초록 ▼

I.제 목: 바이러스 특이효소 저해제 개발 II.연구개발의 목적 및 필요성 유엔 HIV/AIDS계획의 2000년 11월 28일자 보고서에 의하면, 에이즈바이러스 (HIV)와 에이즈(AIDS)감염은 사하라사막 이남 아프리카에서 계속 악화될 것이며 이 제는 동유럽과 러시아에서도 폭발적으로 늘고 있다고 한다.또한,HIV와 에이즈에 감염된 채 살아가고 있는 사람들이 전세계적으로3천610만명 이라고 하며,올해엔 약530만명이HIV에 새로 감염됐으며300만명이 에이즈로 인해 사망할 것이라고 예 측했다.에이즈 감염이 시작된 이래 지금까지 이

I.제 목: 바이러스 특이효소 저해제 개발 II.연구개발의 목적 및 필요성 유엔 HIV/AIDS계획의 2000년 11월 28일자 보고서에 의하면, 에이즈바이러스 (HIV)와 에이즈(AIDS)감염은 사하라사막 이남 아프리카에서 계속 악화될 것이며 이 제는 동유럽과 러시아에서도 폭발적으로 늘고 있다고 한다.또한,HIV와 에이즈에 감염된 채 살아가고 있는 사람들이 전세계적으로3천610만명 이라고 하며,올해엔 약530만명이HIV에 새로 감염됐으며300만명이 에이즈로 인해 사망할 것이라고 예 측했다.에이즈 감염이 시작된 이래 지금까지 이 질환 사망자는 총2천180만명에 달하고있다.이 수치는 세계보건기구(WTO)가1990년대 초 예상했던 것보다50%이상 늘어난 것이다.특히 아프리카의 에이즈 실태는 파멸적이며 가장 큰 우려 원인은 향후2-3년에 걸쳐 이 질환 감염이 악화될 것이라는 주장이 지배적이다.또한 세계 최악의 감염지역인 사하라 이남 아프리카에서는 올해HIV감염자 수가380만명으로 추산되며 이로써HIV/AIDS의 총 감염자 수는2천530만명에 달할 것이라고 전망하고 있다.아프리카엔 세계적으로HIV/AIDS에 감염된 성인의70%와 어린이의80%가 살 고있다고 한다.두 번째로 타격이 심한 지역은 남아시아와 동남아시아로HIV/AIDS 감염자 수가 총580만명에 이른다.동아시아와 태평양지역은 대조적으로 감염자 수 가64만명선에 머물고 있다.감염자 수가 세번째로 높은 지역은HIV/AIDS감염자 수가140만명인 남미지역이다.동유럽에서는HIV/AIDS감염자 수가1년 전의42만 명에서 무려70만명으로 약2배 이상 증가하였다. 국내의 사정을 보면,우리 나라에서는1985년에 국내에서 처음HIV/AIDS감염자 가 발견된 이래 매년 증가하여 2000년3월말 현재 보건복지부에서 집계하고 있는 감염자수는 1,122명이다.이중 251명은 사망하였고 177명이 환자로 전환되었다. 2001년4월 현재 HIV/AIDS감염자수는 총1,350명으로 여전히 증가 추세를 보이고 있으며,통계에 포함되지 않은 숫자를 포함하면 실제 감염자 수는 이 보다3배 이 상으로 추정되고 있다. 경제적 측면에서HIV/AIDS감염은 인간적 고통 외에도 개발도상국의 경제성장에 걸림돌이 되고 있다.세계보건기구(WHO)에 의하면,에이즈,결핵,말라리아 등3대 전염병으로 매년3억명 이상의 환자가 발생하고500만명 이상이 사망하는 등 이들 전염병이 개발도상국 국민 사망원인의 절반 가량을 차지하고 있다고 한다.따라서 이들 질병이 계속 방치되면 농업 산업 생산 감소에 이어 정치 사회 경제적 안정을 저해하고 안보에도 지장을 초래하게 된다고 WHO는 경고하고 있다.경제적 손실로 보면,성인 인구의20%이상이 에이즈에 감염된 나라는 매년GDP의1%가 감소되는 경제적 부담을 안게 된다고 한다.예방측면에서도 남아공을 제외한 사하라 사막 이 남 아프리카 지역에서 지난해 에이즈 예방에 지출된 총비용은1억6500만달러에 달 했으나 현재 추산되는 비용은 예방에만25억달러에 이르는 등 치료비용까지 포함하 면 막대한 자금이 소요된다고 한다. 한편,더욱 심각한 문제는 기존 에이즈 치료약에 내성을 갖는 신종 에이즈바이 러스(HIV)에 걸린 환자들이 점점 더 늘고 있다는 사실이다.영국 공중보건실험실 (PHLS) 연구진은2000년도에HIV에 새로 감염된 환자들의4분의1이상이 이 바이러 스 감염자일 것으로 추정하고 있다.과거 지난1994 2000년에는 이 바이러스 감염 자가14%밖에 안되었는데,이 바이러스에 감염될 위험성은 지난1990년대 내내 매 년 증가했다.따라서 에이즈 백신 및 치료제개발 사업도 여러 가지 신종HIV유형 에 맞춰 내성 에이즈바이러스에 효과가 있는 새로운 치료제 및 새로운 작용기전의 치료제 개발 등 다양하게 개발할 필요성을 보여주고 있다. 본 연구에서는AIDS치료제로 이용될 수 있는 후보물질을 발굴하기 위하여 디히 드록시피론 계열의 비펩타이드성 프로테이즈 저해제,피리미딘디온 계열의 비뉴클 리오시드 역전사효소 저해제,다양한 카페오일 에스테르 계열의 인티그레이즈 저해 제들이II.연구개발의 내용 및 범위 1.비펩타이드성HIVprotease저해제 합성 가.4-Hydroxypyrone계열의protease저해제 합성 나.4-hydroxydihydropyrone계열의protease저해제 합성 다.6-hydroxy-1,3-dioxine-4-one계열의protease저해제 합성 2.천연물로부터HIVintegrase저해제의 분리 및 구조규명 3.HIVintegrase저해제의 합성 가.Dicaffeoyl또는digalloylfuran또는pyrrolidine유도체의 연구 나.Dicaffeoyl또는digalloylglucoside유도체의 연구 4.비뉴클리오사이드 계열의 역전사효소 저해제 합성 5.항바이러스 활성 검색 (Anti-HIV,HSV,HCMV) IV.연구개발결과 비펩타이드성 HIV protease 저해제 개발을 위하여 4-hydroxypyrone, 4-Hydroxydihydropyrone,및6-hydroxy-1,3-dioxin-4-one계열의 화합물들이 합성 되었다.이들 중,KYS420및KYS699(EC50=0.6-0.96M,CC50=33.7-63.1M)는 Pharmacia&Upjohn의 3세대 임상후보물질인 PNU-140690(EC50=0.7 M,CC50= 18.6 M) 과 비교할 때HIV의 복제를 억제하는 활성은 거의 동등하며,독성은2-3 배 약한 우수한 활성을 보여 국내특허로 출원이 되었다. HIVintegrase저해제 개발을 위하여 채집한 식물과 구입한 생약220종을 용매 로 분획하여 얻은 1,236개의 소분획에 대하여 anti-HIV,ant-HSV,anti-CMV, anti-RNA,CT에 대하여 활성을 검색하였다.이들 중,HIVintegrase에 대한 저해활 성을 보이는 식물의 분획을 선정하여 단일성분을 분리,구조규명 및HIVintegrase 에 대한 저해력을 조사하였다. 누리장나무로부터는 HIVintegrase에 저해효과 (IC50=7.860 M)를 보이는7종의phenylpropanoidglycoside계열의 화합물을 분리하여 구조를 규명하였으며,이들 화합물 중에서acteoside는 IC50가 7.8 2.3 M으로 대조물질인L-chicoricacid(IC50=21.0 6.1M)보다 활성이 강하게 나 타났다. 또한,까치박달나무와 정향의 추출물로부터 총14가지의 순수한 성분을 분리하 여 구조를 규명하였으며,이들 중tannin계열의 화합물을 포함한6여종의 화합물들 이integrase에 대하여 강력한 저해작용을 보였다 (IC50=7.0-13.9mg/mL). 천연물로부터의 분리뿐만 아니라 합성에 의한HIVintegrase저해제의 발굴에도 착수하여caffeoyl-furan,caffeoyl-pyrrolidine,caffeoylglucoside등 다양한 유 도체들을 합성하였으며,이들 중 4종 이상이 IC50가 4.7-35.3 mM로 L-chicoric acid(IC50=24.9mM)과 유사 또는 우수한HIVintegrase저해작용을 보였으므로 이들 구조를 토대로 최적화연구를 수행하면 새로운 골격의 선도물질의 도출이 기대 된다. HIV-1의RT저해제로서 AIDS치료제의 후보물질을 탐색하기위하여2,4-피리미딘 디온 계열의 유도체 화합물들을wildtype및mutantHIV-1에 대하여 구조활성상관 관계를 살펴보았다.이를 위하여173개의2,4-피리미딘디온 유도체들을 합성하였는 데, 그 중에서 KRV-1890과 KRV-1903은 wildtype 뿐만 아니라 K103N,Y181C, V106A,V106I,L100I,G190A,P225H,P236L및Y188C와 같은singlemutantRT를 가진 HIV-1에 대해서 좋은 활성을 보여 주었다. 또한 이들은 K103N/G190A, K103N/P225H, K103N/V108I, K103N/L100I, V106A/Y181C, V106I/Y181C 및 A108I/Y181C와 같은doublemutantRT를 가진HIV-1에 대해서도 좋은 활성을 보여 주었다.따라서,KRV-1890과KRV-1903을 전임상단계의 시험을 위한 후보물질로 선 정하였다. 이외에도,4,6-다이메틸피리미딘-2-일-싸이오기 및4,6-다이메틸피리딘-2-일-카 르보닐기를 도입한2,4-피리미딘디온??딘-2-일-카르보닐기가 도입된 화합물들은 0.003 / 의 활성을 나타내었으며, 독성은AZT보다10배 정도 낮았다. 활성검색 분야의 경우,의뢰되는 시료들의 항바이러스 활성 및 독성평가를 세포 배양체계에서 수행하였으며,효소 저해제의 구조 활성관계를 조사하기 위해 중요한 바이러스 특이효소에 대한 저해력을 평가하였으며,저해력 평가체계가 갖추어지지 않은 경우 평가 체계를 확립하였다.AIDS치료제를 개발목표로 세포배양체계를 이용 한 항HIV약효 평가 및 HIVreversetranscriptase(RT)와HIVprotease저해력을 평가하고,herpes치료제 개발을 위해서 항herpessimplexvirustype1(HSV-1), 항HSVtype2(HSV-2) 및 항humancytomegalovirus(HCMV) 활성을 세포배양체계에 서 평가하고,효소 저해력 평가체계를 갖추기 위해 효소 구입이 어려운 HSV-1 protease유전자를 대장균에 발현시켜 단백질을 분리 정제하여 효소 활성 평가체 계를 갖추었다. V.연구개발결과의 활용계획 본 과제의 연구 결과를 종합해 볼 때,HIVprotease 저해제의 경우는 기존 protease저해제에 내성을 보이는HIV에도 효과적이며 독성이 낮은 우수한 화합물 이 도출되었지만 세계시장에HIVprotease저해제 계열의 치료제가 임상에 많이 사 용되고 있어 시장규모가 그리 크지 않을 것으로 보이지만,HIVintegrase저해제 분야는 현재까지 개발되지 않은 점을 감안하면 개발만 된다면 기존의 치료제를 대 신할 가능성이 높고,시장규모가 매우 클 것으로 보이므로 지속적인 연구를 수행하 고자 한다. 또한,2,4-피리미딘디온 계열의 화합물 중에서 wildtype의 HIV-1은 물론 K103N,Y181C,K103N/Y181C이외에도 큰 문제가 되고 있는 여러 가지의 또 다른 mutantRT를 가진HIV-1에 대해서도 최적의 활성도를 가진 화합물을 창출하고자 하 였다.시험은 아직도 진행 중이므로 최적의 화합물이라 할 수는 없으나,현재까지 시험한 화합물 중에서는KRV-1890과KRV-1903이K103N/Y181C의doublemutant를 제 외하고는 대부분의 문제가 되고 있는mutantRT를 가진HIV-1에 대해서nanomolar 또는subnanomolar의EC50 값을 가졌으므로 본 연구에서는1차로 이들을 후보물질로 선정하였다. 이 화합물들은 독성이 매우 낮을 것으로 판단되며 (KRV-1890의 SI >10,000,KRV-1903의 SI=23,000),특히AZT와 같은 nucleoside계열의 기존AIDS 치료제와 병행요법제로 사용하기에 적합한 것으로 사려된다.따라서,상기 2가지 화합물들에 대한pharmacokinetics및 기타 약리시험등의 전임상단계시험을 2단계 연구기간 동안에 수행하고자 한다.

Abstract ▼

I.Title Development of Virus Specific Enzyme Inhibitors II.Objectives and Importance of the Study There area fewantiviral agents to treat thediseasescausedbyviral infectionandnoagentcaneradicatethevirusinpersistentlyorlatently infected.FromtheexperiencesindevelopingAIDSdrugs,combinationtherapy

I.Title Development of Virus Specific Enzyme Inhibitors II.Objectives and Importance of the Study There area fewantiviral agents to treat thediseasescausedbyviral infectionandnoagentcaneradicatethevirusinpersistentlyorlatently infected.FromtheexperiencesindevelopingAIDSdrugs,combinationtherapy withmorethan2drugsisrequiredtohavehigherefficacyandtoinhibit emergence of drug resistant viral strains efficiently. Also once drug-resistantvirusappears,itcausesuselessofnotonlythedruginusing butalsootherdrugswithsimilardrug-resistanceprofiles.Searchingfornew antiviralcandidates,especiallyinhibitorsofviralspecificenzymesis important.Itiswellknownthatover20millionpeoplearepositiveagainst HIV-1.Ofthem,about5millionpeopleareAIDSpatientsand1.5million peoplearedyingwithAIDSeveryyear.Although13compoundsareapprovedby FDAasdrugsforAIDS,newdrugsarestillrequiredduetothemutationof HIV-1againsttheknowndrugs.Inordertosearchforthenewantivirals againstHIV,dihydroxypyronederivativesasnonpeptidicproteaseinhibitors, 2,4-pyrimidinedione derivatives as non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, and dicaffeoyl esters as HIV integrase inhibitors were synthesized.Also,astudyforHIVintegraseinhibitorsfromthenatural plantswerecarriedout.Inthisreportthesearchforthecandidatesfornew antiviralsaredescribedincludingthestructuralidentificationandfor theirbiologicalactivities. III.ContentsandScopeoftheStudy 1.SynthesisofnonpeptidicHIVproteaseinhibitors 가.Synthesisof4-HydroxypyronesasHIVproteaseinhibitors 나.Synthesisof4-hydroxydihydropyronesasHIVproteaseinhibitors 다.Synthesisof6-hydroxy-1,3-dioxine-4-onesasHIVproteaseinhibitors 2.IsolationofHIVintegraseinhibitorsfromplants 3.SynthesisofHIVintegraseinhibitors 가.Synthesisofdicaffeoylordigalloyl-furanandpyrrolidines 나.Synthesisofdicaffeoylordigalloylglucosides 4.SynthesisofnonnucleosideHIVreversetranscriptaseinhibitors 5.Anti-viralactivityscreeningofcompounds(Anti-HIV,HSV,HCMV) IV.ResultsandDiscussion TofindoutleadcompoundsfortreatmentofAIDS,theinhibitorsof threeenzyme,whicharecrucialforthereplicationofHIVwerestudied. For the development of nonpeptidic HIV protease inhibitors, 4-hydroxypyrone, 4-Hydroxydihydropyrone,and6-hydroxy-1,3-dioxin-4-one derives were synthesized. Among them, two compounds from 4-hydroxydihydropyrone and 6-hydroxy-1,3-dioxin-4-one series were equipotenttoracemicformofPNU-140690 (EC50=0.6-0.96 M,CC50= 33.7-63.1 M) whereastheircytotoxicitieswerelessabout2-3times. ForthedevelopmentofHIVintegraseinhibitorsfromnaturalproducts, 500speciesfromcollectedplantsandpurchasedmedicinalherbswere partitionedbysolventsto1,236smallfractions.Thesefractionswere testedforanti-viralactivitiesagainstHIV,HSV,HCMV,CT,andHIV integrase.Theisolation,structuredetermination,andHIVintegrase inhibitoryactivityscreeningwereperformedfromactivefractions.Seven phenylpropanoidglycosides,whichshowpotentHIVintegraseinhibitory activities (IC50 = 7.860 M) were isolated from Clerodendron trichotomum. Among isolated compounds, acteoside exhibited stronger inhibitoryactivity(IC50=7.8 M) thanL-chicoricacid(IC50=21.06.1 M).14PurecompoundsalsoisolatedfromCarpinuscordataandfloraof EugeniaCaryophyllataThunb.Amongthem,seventannincompoundsshowed potentinhibitoryactivitiesagainstHIVintegrase (IC50=7.0-13.9 m g/mL). Synthesis of caffeoyl-furan, caffeoyl-pyrrolidine and caffeoylglucosideasHIVintegraseinhibitorswasalsoaccomplishedin thisstudy.Becausefourcompoundsfromtheseserieswereequipotentto armorepotentthanL-chicoricacid(IC50=4.7-35.3mM),thedevelopment ofnewleadcompoundsforHIVintegraseinhibitorsareexpectedbythe modificationofstructuresofsynthesizedcompounds. Tofindoutnonnucleosidereversetranscriptaseinhibitorsasa candidate for a drug development for AIDS, structure-activity relationships(SAR) of2,4-pyrimidinedionederivativesagainstwildtype andmutantHIV-1havebeenstudied.ForSARstudies,173derivativesof 2,4-pyrimidinedionehavebeenpreparedandtested.Ofthem,KRV-1890and KRV-1903showedpotentactivityagainstwildtypeandsinglemutantHIV-1 suchasK103N,Y181C,V106A,V106I,L100I,G190A,P225H,P236L,and Y188C.Andalsothesecompoundsshowedpotentactivityagainstdouble mutantHIV-1suchasK103N/G190A,K103N/P225H,K103N/V108I,K103N/L100I, V106A/Y181C,V106I/Y181C,andA108I/Y181C.Therefore,thesetwocompounds wereselectedascandidatesforpreclinicalstudies. Additionally, 4,6-dimethylpyrimidin-2-yl-thio- and 4,6-dimethyl pyrimidin-2-yl-carbonylderivativeswerealsosynthesized.Amongthem, 4,6-dimethylpyrimidin-2-yl-carbonylderivativesshowedpotentactivity (IC50,0.003 / ) against wild type HIV along with 10times less cytotoxicityincomparisonwithAZT. On the other hand, the aims of screening team were 1) the establishmentofevaluationsystemstomeasureinhibitingabilityof compounds on viral specific enzymes, 2) performing evaluation of antiviralactivityofcompoundsagainstseveralvirusesincellculture systems,3) performingevaluationofviralspecificenzymeinhibitionof compounds. Antiviral activity of compounds wereevaluated in cell culture systems.During3yearsforthisstudywehavereceived2063samplesfrom 5 different sources including 2 institutes - KRICT and KIST, 1 pharmaceuticalcompanyand2universities.Amongthem1240compoundswere chemicallysynthesizedand813werenaturalproductsoriginatedfrom plants.SearchingfornewAIDSdrugcandidatesanti-HIV-1and-HIV-2 activitywasmeasuredbyusingCPEinhibitionassayinMT-4cellculture system.Toevaluateanti-herpeticefficacyVerocellswereinfectedwith HSV-1orHSV-2andsensitivitytotestcompoundswasmeasuredbyCPE inhibitionassay.Anti-CMVactivitywasmeasuredbyCPEinhibitionassay and HEL 299cellswereusedforit.InHeLacellculturesystem antiviralactivityagainstpoliovirus,coxsackieB3virusandvesicular stomatitisviruswasalsotestedbyusingCPEinhibitionassay.Toget more detailed cytotoxicity profiles, if necessary, cytostatic and cytocidaleffectofcompoundsweremeasured.2057compoundsweretested fortheiranti-HIV,1817foranti-HSV,17foranti-CMVactivity, 1122 foranti-RNAviruses,and6 forcytotoxicactivity.HIVRTinhibition assaywasperformedfor17non-nucleosideHIVRTinhibitorsandHIV protease assay for 138 nonpeptidomimetic protease inhibitors. The compoundshaveshownantiviralactivityduringthisstudyshouldbe furtherevaluatedtojudgetheirvaluesasdrugcandidatesandalso searchfornewanti-viralsshouldbecontinued. V.ApplicationoftheResearch KRV-1890andKRV-1903showedpotentactivitynotonlyagainstwild typeandsinglemutantHIV-1suchasK103N,Y181C,V106A,V106I,L100I, G190A,P225H,P236L,andY188CbutalsoagainstdoublemutantHIV-1such as K103N/G190A, K103N/P225H, K103N/V108I, K103N/L100I, V106A/Y181C, V106I/Y181C,andA108I/Y181C.Therefore,furtherintensivepreclinical evaluations,forexample,invivotest,pharmacokinetics,etc.willbe performedintheToxicologyDivisionofKRICT,RegaInstituteofBelgium, andGlaxoWellcome.Ifwefindoutsuitablecompoundsascandidatesfor anti-AIDSdrugs,wewilllicenseoutthesecompoundstoGlaxoWellcomeor anotherpharmaceuticalcompany. Additionally,sincethereinnoAIDSdrugyetintheworld-wide market,whichhasHIVintegraseinhibitoryactivity,thestudyinthis field becomes more important andwill be continuedbased on the structure-activityrelationshipofderivedcompounds.

목차 Contents

• 제1장 서 론...16
• 제2장 국내외 기술개발 현황...20
• 제3장 연구개발 수행내용 및 결과...26
• 제1절 한국과학기술연구원...26
• 제2절 한국화학연구원I...156
• 제3절 삼진제약...212
• 제4절 한국화학연구원II...240
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...275
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...279
• 제6장 참고문헌...281
• 부 록...287
• 제1위탁과제...289
• 제2위탁과제...323
• 제3위탁과제...401