초록 ▼

일반적으로 노화는 나이를 먹으면서 신체의 구조와 기능이 점차 떨어져 환경에 적응하기 어렵게 되면서 결국 죽음에 이르게 되는 하나의 과정을 말한다. 노화는 20세가 지나면서 서서히 시작되고 40세 이후에 본격적으로 진행된다. 물론 노화현상이 나타나는 시기와 노화의 정도는 개인의 생리적 상태와 주어진 환경에 따라 다르다. 하지만 아직까지 노화를 일으키는 원인은 정확하게 밝혀져 있지 않다.최근 노화에 따른 여러 질환 중 특히 뇌질환에 대한 연구가 세계적 이목을 집중시키고 있고 20세기가 주로 암이나 에이즈에 대항해 싸우는 시대라면 21세

일반적으로 노화는 나이를 먹으면서 신체의 구조와 기능이 점차 떨어져 환경에 적응하기 어렵게 되면서 결국 죽음에 이르게 되는 하나의 과정을 말한다. 노화는 20세가 지나면서 서서히 시작되고 40세 이후에 본격적으로 진행된다. 물론 노화현상이 나타나는 시기와 노화의 정도는 개인의 생리적 상태와 주어진 환경에 따라 다르다. 하지만 아직까지 노화를 일으키는 원인은 정확하게 밝혀져 있지 않다.최근 노화에 따른 여러 질환 중 특히 뇌질환에 대한 연구가 세계적 이목을 집중시키고 있고 20세기가 주로 암이나 에이즈에 대항해 싸우는 시대라면 21세기는 인류가 치매와 같은 뇌질환과 맞서야 하는 시대가 전개될 전망이다. 뇌질환은 직간접적으로 인체의 모든 기능에 영향을 줄 뿐만 아니라 특히 활동이나 행동의 장애와 더불어 인지기능의 감소로 인한 정신적 장애를 유발한다. 그리고 신체적, 정신적 장애는 개인의 문제에 그치지 않고 가족구성원의 사회활동을 제한시키고, 사회비용을 증가시키는 등 사회문제로 확대되기 때문에 뇌의 노화에 대한 연구가 사회적으로 요구되는 것이다. 뇌의 노화와 퇴행성 신경질환과의 상관관계에 대해서는 아직 완전하게 밝혀져 있지 않으나 두가지 과정간에는 뇌세포의 소멸과 뇌 용량감소 등 공통된 특성들이 많이 나타나고 있다. 그러므로 노화에 따른 변화와 더불어 퇴행성 신경질환에 대한 연구도 뇌의 노화를 연구하는 측면에서 같이 연구되어야 할 것이다.본 연구에서는 전년도에 보기(補氣), 보혈(補血), 보양(補陽) 및 보음(補陰)의 7가지 한약탕제 처방을 이용하여 항산화효과, H₂O₂와 glutamate에 의한 신경세포의 퇴행억제 효과와 파킨슨씨병에 대한 한약탕제의 효과에 대한 연구를 수행하여 효과를 나타낸 탕제에 대해 동물실험을 실시하였고, 중풍의 예방 및 치료에 사용되는 탕제를 선택하여 in vitro 연구를 수행했다. 그리고 노화와 정신적 스트레스 및 중풍의 후유증 경감효과에 대한 한약의 효능을 조사하기 위하여 한약 탕제가 기억·학습능력에 미치는 효과에 대해 연구를 수행하였다.1. 기억·학습 효과에 대한 연구뇌 신경 세포에 손상을 주어 기억/학습 능력을 감퇴시킬 수 있는 요인으로서 노화와 정신적 스트레스를 가상하여 전년도 연구과제에서 뇌조직 보호효과가 있는 것으로 판명된 육미지황원 및 여타 한약재를 사용하여 실험하였다. 노화 모델은 노화 촉진 마우스(SAM)을 32주간 사육하며 Morris-Water Maze를 통해 기억/학습 능력을 측정하였으며, 스트레스 모델로는 4주간의 고정화 스트레스 방법을 이용하였다. 노화 모델에서 육미지황원은 32주령에서 비투여군보다 탐색 시간에서 우위를 보였으며. 스트레스 모델에서도 탐색시간과 탐색 거리 모두에서 유의적 결과를 얻어 기억/학습 능력에서 육미지황원이 유익한 효과를 보인 것으로 사료되었다. 스트레스시 발생하는 산화적 손상의 결과에서도 육미지황원은 뇌 조직에 대한 보호 효과를 보였다.2. 뇌신경세포의 허혈성 손상에 대한 탕제의 효과 연구뇌혈관 질환중 하나인 중풍은 허혈성과 출혈성으로 구분되며, 허혈성 중풍은 산소 결핍 상태인 hypoxia와 영양분 결핍 상태인 hypoglycemia가 대표적 상태로 나타낸다. 본 연구에서는 허혈성 뇌혈관 질환을 in vitro 상에서 의태하기 위해 human neuroblastoma SK-N-MC와 glioblastoma A172 및 랫트 배아 초대 배양 세포를 이용하여 최적의 조건을 조사하였다. 그 결과 A172와 SK-N-MC를 이용한 조건 검색에서 glucose-free media 상태의 95% N₂5%CO₂ 대기 환경에서 8시간 배양한 후 다시 정상적인 환경에서 24시간 추가배양함으로서 산화적 손상의 증가 및 세포 사멸, xanthine oxidase 활성 증가등을 관찰할 수 있어 허혈상태를 의태하였다고 판단되었다. 이 같은 조건으로 조위승천탕, 육미지황원, 대승기탕, 청폐사간탕, 성향정기산, 형방지황탕, 황련해독탕등 현재 중풍 치료 및 효과가 있을 것으로 생각되는 7가지 탕제 추출물의 보호효과를 관찰하였다. 그 결과??. 이중 산화적 손상 억제 결과와 xanthine oxidase 활성 억제 결과 실험에서 육미지황원은 자체 항산화력이 높은 것으로 청폐사간탕은 자체 항산화력과 더불어 xanthine oxidase 활성 억제능이 있는 것으로 생각되었다. 조위승천탕은 항산화력 및 xanthine oxidase 활성 억제능이 우수하지 못하여 다른 경로로 세포를 보호한 것으로 추측된다. 그러나 랫트 배아 초대 배양 세포를 이용한 동일 실험에서는 조위승천탕과 형방지황탕이 우수한 효과를 나타내었다. 세포열과 초대 배양 세포를 이용한 실험에서의 결과의 차이는 세포 자체의 상이성에 기인한 것으로 생각되며 동물 모델등의 도입을 통하여 해결해야 할 문제로 사료된다.3. 파킨슨씨병 동물모델에서 한약탕제의 효과 연구육미지황원과 연령고본단이 파킨슨씨병 동물모델인 MPTP투여 C57BL/6 마우스에 대해 locomotion activity와 rearing에서 통계적으로 유의성 있는 효과를 나타내었고, 도파민 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 tyrosine hydroxylase에 대한 면역조직학적 연구에서도 유의적인 효과를 내었으며 Western blot을 이용한 분자생물학적인 연구에서도 효과가 있는 것으로 나타냈다. 그리고 파킨슨씨병을 유발하는 도파민의 저하에 대한 탕제효과를 관찰한 결과 육미지황원과 연령고본단을 투여한 군에서 도파민을 증가시키는 효과가 관찰되었으며, 그 작용기전으로 먼저 monoamine oxidase B (MAO-B)를 저해하거나 도파민의 agonist로 역할 그리고 tyrosine hydorxylase (TH)의 유전자의 activator protein 1(AP-1) 결합을 촉진하는 역할을 하는 것으로 추측되었다. 이상의 결과로 육미지황원과 연령고본단이 파킨슨씨병에 대한 뚜렷한 개선효과를 보였다고 사료되었다.

목차 Contents

• 1. 서론...15
• 1. 기억. 학습 효과에 대한 연구...15
• 2. 뇌신경세포의 허혈성 손상에 대한 탕제의 효과 연구...17
• 3. 파킨슨씨병 동물모델에서 한약탕제의 효과연구...22
• 2. 실험방법 및 재료...29
• 1. 기억. 학습 효과에 대한 연구...29
• 1.1 탕제 및 단미재의 제조...29
• 1.2 실험 동물...30
• 1.3 스트레스 조건과 약제의 투여...30
• 1.4 Morris Water-Maze...31
• 1) 수조...31
• 2) 위치 학습...31
• 3) 기억 능력 측정...32
• 4) 자료의 분석...32
• 1.5 실험 동물의 생화학적 분석...32
• 1) 혈장 GOT의 측정...33
• 2) 스트레스 지표 물질의 측정...33
• 3) 산화적 스트레스의 측정...35
• 4) 조직 glutathione의 측정...35
• 5) 항산화 효소 활성의 측정...36
• 1.6 약재의 항산화력 츠정...36
• 1.7 노화에 의한 기억력감퇴에서 육미지황원의 효능...37
• 1.7.1 실험동물...37
• 1.7.2 약제 제조와 투여...37
• 2. 뇌신경세포의 허혈성 손상에 대한 탕제의 효과 연구...38
• 2.1 탕제 추출물의 준비...38
• 2.2 Cell line 및 배양...38
• 2.3 허혈/재관류 조건 검색...41
• 2.4 세포의 산화적 손상 조사...42
• 2.5 GSH와 thiol 함량의 측정...43
• 2.6 Xanthine oxidase 활성의 측정...43
• 2.7 Superoxide dismutase 및 catalase 활성의 측정...44
• 2.8 탕제의 준비 및 추출...44
• 2.9 탕제의 항산화력 측정...45
• 2.10 일차배양 세포에서 보호 효과...46
• 2.10.1 신경세포배양...46
• 2.10.2 Lactate Dehydrogenase(LDH) 측정...47
• 3. 파킨슨씨병 동물모델에서 한약탕제의 효과 연구...48
• 3.1 탕제 추출물의 준비...48
• 3.2 실험동물과 MPTP 및 탕제 투여...48
• 3.3 Locomotor activity & rearing 측정...50
• 3.4 뇌의 tyrosine hydroxylase에 대한 면역조직화학법 (immunohistochemistry method)에 관한 관찰...51
• 3.5 TH immunoblotting (Western blot)...52
• 3.6 뇌의 도파민 정량...52
• 3.7 뇌의 ATP 정량...53
• 3.8 뇌의 각 부위별 지질과산화 측정...54
• 3. 연구결과...56
• 1. 기억. 학습 효과에 대한 연구...56
• 1.1 약재의 항산화력 측정...56
• 1.2 기억 학습 능력 측정...56
• 1.3 실험 동물의 생화학적 측정...58
• 1.3.1 스트레스 지표 물질의 측정...58
• 1.3.2 체중 및 sGOT의 측정...59
• 1.3.3 뇌 조직의 산화적 손상...60
• 1.3.4 뇌조직 glutathione 함량의 변화...60
• 1.3.5 뇌조직내의 SOD 및 catalase 활성...61
• 1.4 노화에 따른 기억학습 능력 측정...62
• 2. 뇌신경세포의 허혈성 손상에 대한 탕제의 효과 연구...80
• 2.1 lschemia 조건의 확립...80
• 2.1.1 세포 생존율의 비교...80
• 2.1.2 lschemia 환경에서 산화적 손상...82
• 2.1.3 Xanthine oxidase (XO)의 활성 측정...83
• 2.2 한약 탕제의 보호 효과...84
• 2.2.1 탕제의 항산화력 측정...84
• 2.2.2 탕제의 세포 독성 측정...85
• 2.2.3 탕제의 세포 보호 효2.2.5 Xanthine oxidase 억제 능력의 측정...87
• 2.3 초대배양 신경세포에서 보호작용...88
• 3. 파킨슨씨병 동물모델에서 한약탕제의 효과 연구...104
• 3.1 Locomotor activity & rearing 측정...104
• 3.2 TH 면역조직화학법 (immunohistochemistry method)...105
• 3.3 TH immunoblotting (Western blot)...106
• 3.4 Dopamine 정량...107
• 3.5 ATP 정량...108
• 3.6 뇌 각 부위별 지질과산화 측정...109
• 4. 고찰...124
• 5. 참고문헌...146