초록 ▼

I. 제목 : 초고분해능 마이크로이미징 시스템 개발 및 응용
II. 연구개발의 목적 및 필요성
NMR 마이크로이미징은 생명체에 손상을 주지않고 살아있는 상태에서 내부구조를 관찰할 수 있으며 실시간 분석도 가능하다. 마이크로이미징은 인간 두뇌 구조 및 기능 연구, 질병진단, 개체 발생시 분화과정 연구, 등 생명 및 의과학에 매우 광범위하게 응용되고 있다. 현재 임상용 MRI는 분해능이 약 1mm, 연구용은 20∼100Mm으로서, 마이크로이미징의 최대 과제는 분해능을 현미경 수준(<1Mm)으로 높이는 것이다. 분해능

I. 제목 : 초고분해능 마이크로이미징 시스템 개발 및 응용
II. 연구개발의 목적 및 필요성
NMR 마이크로이미징은 생명체에 손상을 주지않고 살아있는 상태에서 내부구조를 관찰할 수 있으며 실시간 분석도 가능하다. 마이크로이미징은 인간 두뇌 구조 및 기능 연구, 질병진단, 개체 발생시 분화과정 연구, 등 생명 및 의과학에 매우 광범위하게 응용되고 있다. 현재 임상용 MRI는 분해능이 약 1mm, 연구용은 20∼100Mm으로서, 마이크로이미징의 최대 과제는 분해능을 현미경 수준(<1Mm)으로 높이는 것이다. 분해능이 1Mm에 도달하는 초고분해능 마이크로이미징 시스템이 개발될 경우 세포를 분별할 수 있으므로 두뇌연구와 질병진단에 획기적인 기여를 할 수 있다. 초고분해능 마이크로이미징 시스템 개발은 물리학, 생물학, 생물물리학적 지식이 모두 필요하므로 학제간 공동연구가 필수적이다.
III. 연구개발의 내용 및 결과
(1) 초고분해능 마이크로이미징 시스템 개발 1
1. High sensitivity NMR Microscopy probe 개발
고경사자계 gradient coil 시스템 개발 : 경사자기장의 설계 및 제작에 있어서 gradient의 세기, 균일도, 기계적 강도등이 요구된다. 본연구에서 1000 G/cm 가 넘는 gradient field를 내고 micron 분해능 실험에 필요한 큰 gradient pulse에도 견딜 수 있는 gradient coil set을 제작하는데 성공하였다.
나. 고감도 rf 프로브 개발 : 외경 0.45 mm tube에 코일을 감아서 600 MHz에서 공명시켰을 경우 같은 FOV와 slice thickness에 대하여 가장 높은 S/N을 주는 rf coil의 wire diameter와 turn 수의 combination을 실험적으로 구했다. 0.12mm copper wire를 5 turn 감았을 때 공명 조건과 S/N이 가장 좋음을 확인하였고 이 조건을 high resolution imaging에 사용하였다.
2. 저잡음 preamp와 일체형 probe 개발
3. 초전도 코일 probe 개발 : 본 연구에서는 액체질소에서 초전도성을 유지할 수 있는 YIBa2Cu3O7 (YBCO)라는 고온초전도체를 이용하여 핵자기공명현미영상용 박막코일을 제작하였고, 이에 대한 특성을 조사하였다.
5. Microstructured 실리콘 인공 구조물의 개발 : 본 과제를 통해 개발된 microscopy probe의 분해능을 엄밀하게 확인하기 위해 실리콘 wafer를 식각하여 1Mm 단위의 미세 구조물을 제작하였다.
(2) 초고분해능 마이크로이미징 시스템 개발 2
MRFM 개발 및 신호획득 :Magnetic resonance signal을 기존의 NMR, EPR에서는 유도코일을 사용해서 얻는 반면에 MRFM의 경우는 micron size의 cantilever의 mechanical한 진동으로서 얻는다. 즉, 자기 공명에 의한 자화의 변화가 기존의 NMR, EPR에서는 유도코일에 기전력을 유도시키고 이 전기적인 신호를 코일의 impedance변화 등에 의해 측정한다. 반면에 MRFM은 자기공명방법에 의해서 변화한 시료의 자화가 gradient field 하에서 받는 magnetic force에 변화를 주어, 이것이 cantilever에 mechanical oscillation을 유발하게 되므로 이 진동진폭을 측정하여 자기공명신호를 얻을 수 있다. MRMF에 있어서 가장 중요한 논점 중에 하나는 바로 force resolution 이다. Mechanical detection이 inductive detection을 능가할 수 있는 이유도 micro-mechanical cantilever가 매우 작은 힘을 측정하는 것이 가능하기 때문이다. MRFM을 궁극적인 목표인 angstrom-scale에서의 single spin detection을 위해서는 force resolution을 훨씬 더?? 부터의 EPR 신호를 보았다. 이 후 장비에서의 각 부분들에 대해서 조정함으로써, 보다 나은 SNR과 그에 따른 결과를 얻을 수 있으리라고 본다. 그 가능성으로는 Fidld gradient를 증가시키는 것에 비례하여 MRFM imaging시의 해상도를 높일 수 있다.
(3) 마이크로이미징 영상 획득
1. 최적 pulse sequence의 개발 : 확산 효과를 줄이기 위해 우리는 asymmetric echo acquisition 방법을 사용하였다. Asymmetric echo acquisition으로부터 얻어진 data로부터 영상을 재구성하기 위한 partial Fourier reconstruction 방법이 연구되었고 이를 위한 C 프로그램이 작성되었다.
2. 1 Mm resolution capillary phantom 영상 : Phantom은 두 개의 capillary를 외경 450Mm, 내경 300 Mm의 유리관 속에 넣어 제작하였다. 1Mm 영상은 FOV 500Mm, matrix 512×512, slide thickness 75Mm 에 SNR 4.6으로 얻었고, 분해능이 1Mm 임을 확인하였다.
3. 2Mm resolution plant cell 영상 : 사용된 생물시료는 제라늄(geranium)이다. 분해능 2Mm의 영상은 FOV 1000 Mm, matrix 512×512, slide thickness 50Mm에서 얻었다. 미세 메포들은 광학현미경 상에서 검게 나타나서 구별할 수 없는 반면, 우리가 얻은 2Mm pixel NMR 영상에서는 확실하게 구별되고 있다.
4.Micro-structured silicon 구조의 영상화 : 실리콘 미세 구조물에 대한 세계 최초의 1Mm pixel 영상을 얻었고, 이 영상에서는 strip pattern이 더 선명하게 나타나고 영상의 왜곡도 줄어든 것을 볼 수 있었다.
5. 생쥐 난자 영상 : 생쥐 난포는 5.5Mm×5.5Mm×100Mm 분해능으로 세포가 살아있는 상태에서 영상을 얻었다. 영상에서 oocyte의 경계선이 뚜렸하게 구별되고 내부구조를 확인할 수 있었다.
(4) 생쥐 두뇌 연구
1. 간질에 동바되는 뇌의 구조적변화 : 4.7T MRI 시스템을 이용하여 마이크로이미징을 수행하였다. 마이크로이미징 결과와 해부학적 결과 모두 DG 신경세포들은 별 영향이 없는 반면 CAI 신경세포들은 대부분 사멸하여 cell body layer가 소실된 것으로 나타났다. 즉 마이크로이미징과 기존 해부학적 방법과의 결과가 일치하였다.
2. 전기적 해마 손상에 동반되는 행동 및 뇌구조 변화 : 간질연구와 마찬가지로 마이크로이미징으로 측정한 신경계 손상과 기존 해부학적 방법으로 측정한 손상이 일치하였다. 이 결과는 마이크로이미징 방법을 행동신경과학 연구에 성공적으로 적용할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
3. 화학적 해마 손상의 뇌영상화 : 두뇌를 적출하지 않고 생쥐를 마취시킨 상태에서 마이크로이미징으로 측정한 신경계 손상과 기존 해부학적 방법으로 측정한 손상이 일치하였다.
(5) 발생연구 및 실시간 세포분석법 개발
1. 발생과정연구 : 수정란의 체외발생을 성공적으로 완성함으로써 confocal microscope와 마이크로이미징에 의한 실시간 분석체제 구축을 완성하였다.
2. 세포조절물질의 실시간 분석 : EGF에 의한 세포내 Ca2+ 증가가 활성산소의 증가에 의한 것임을 규명하였다.
3. Mouse oocte 발생기작 분석 : RhoA에 의해 조절된 활성산소가 oocte의 발생을 조절하였다. 또한 oocyte의 정상적인 발생에 tissue type transglutaminaserk 필수적인 역할을 수행하였다.
4. DPD 유전자 발현 : DPD 유전자는 원인을 알 수 없는 요인에 의해 동물세포에서 발현되지 않으며 one cell embryo 단계에서 GFP-conjugated gene의 발현은 적합하지 않았다.
IV. 연구개발결과의 활용계획
개발된 마이크로이미징 시스템은 생명체에 비파괴적이며 손상을 주지 않으므로 생물체 세포의 발생 과정 연??이크로이미징으로 시도해 볼 수 있겠다. 본 시스템에 접목할있다. 마이크로이미징의 두뇌 연구 응용에 있어 적용?Tejs 부위는 해마였다. 마이크로 이미징 방법을 이용해 학습 및 기억에 있어서 해마의 정확한 기능이 무엇이가, 그리고 알츠하이머병 동물모델이 나이가 듦에 따라 해마 손상이 어떻게 진전되는가를 연구할 예정이다.

Abstract ▼

SUMMARY
Development and application of High Resolution NMR Microimaging System
We are able to observe the structue of the interior of the body without harming the life of destruction of the body by using NMR microimaging. The microimaging have variety of application in life science and clini

SUMMARY
Development and application of High Resolution NMR Microimaging System
We are able to observe the structue of the interior of the body without harming the life of destruction of the body by using NMR microimaging. The microimaging have variety of application in life science and clinical science including brain study, diagnosis of desease, development study of embryo. The resolving power of clinical MRI is more than 1 mm. The goal of the microimaging is developing the system having the resolving power upto 1 um which is comparable to optical microsopy. When the high resolution microimaging system are developed, it is possible to observe cellular structure so that it contribute to brain research and diagnosis of deseases. In this research, we have developed high sensitivity nmr microscopy probe, highly inclined field gradient coil system, high sensitivity rf coil probe, low noise preamp and single body probe. To obtain high resolution microimage, we developed a magnetic resonance force microsopy (MRFM) and obtain a EPR signal from DPPH. We have developed an optimized pulse sequence for the microimaging the can overcome the diffusion induced signal canceling. An asymmetric echo acquisition methods was used and reconstruct the image by partial Fourier reconstructuion. By using the methdos and microimaging system, we have obtained 1 um resolution capillary phantom image, 2 um resolution plant cell image, micro-structured silicon structure image and one cell image from oocyte of mouse. In this resarch the microimaging was applied to brain study of mouse. Brain tissues are damaged by electricity or chemicals and monitored by microimaging and conventional anatomic methdos. The two methods show similar result suggesting that microimaging can be used brain study and neurology. We have monitored the developmental courses of oocyte and observed the effects of EGF and transglutaminase of the development of oocyte. In this research we developed a microimaging system that is non-destructive and non-invasive. It can be used in the genetic revelation study and functional brain study.

목차 Contents

• 제1장 서론
  1. 본 과제의 성격 (요약)
  2. 연구개발의 필요성
  제2장 국내외 기술개발 현황
  1. 고분해능 마이크로이미징 시스템
  2. Magnetic Resonance Force Microscopy (MRFM)
  3. 마이크로이미징 시스템의 두뇌연구에의 응용
  제3장 연구개발수행 내용 및 결과
  제1절 초고분해능 마이크로이미징 시스템 개발 1 : NMR Microscope 개발
  1. High sensitivity NMR Microscopy probe 개발
  가. 고경사자계 gradient coil 시스템 개발
  나. 고감도 rf 프로브 개발
  2. 저잡음 preamp와 일체형 probe 개발
  3. 초전도 코일 probe 개발
  가. 서론 및 이론
  나. 방법 및 설계
  다. 결과
  라. 결론
  5. Microstructured 실리콘 인공 구조물의 개발
  가. 패턴 설계
  나. Mask 제작
  다. 실리콘 식각
  라. 산화막 입히기
  마. Dicing
  제2절 초고분해능 NMR microscope 개발 2 : MRFM 개발 및 신호획득
  1. MRFM의 원리
  가. Inductive Detection과 Mechanical Detection
  나. Force Resolution
  다. Single Spin Detection
  라. MRFM의 기본 동작 원리
  마. Second Harmonic Detection 방법
  2. MRFM 장비개발
  가. 장치 일반
  나. 광간섭계
  다. Cantilever 제어
  라. 기타 장치
  3. 신호포착 최적조건
  가. 초기 신호 포착
  나. 시료의 모양와 크기에 대한 신호 형태
  4. 장비의 개선 및 재구성
  가. RF coil의 교체
  나. Scanning coil 및 modulation 코일의 교체
  다. 광섬유 간섭계의 열선 Feedback
  라. 시료 접착
  마. Cantilever의 금속반사 코팅제거
  바. 기타
  5. 실험결과
  제3절 마이크로이미징 영상 획득
  1. 최적 pulse sequence의 개발
  가. 서론
  나. 확산에 의한 신호감쇄
  다. T2 이완시간에 의한 신호감쇄
  라. 확산, T2 이완, bandwidth 로부터의 총 SNR
  마. T1 및 repetition time에 따른 SNR 의존성
  바. Partial Fourier imaging
  2. 1㎛ resolution capillary phantom 영상
  가. 시료 준비
  나. T1, T2 및 확산 상수 측정
  다. 영상화 상수의 최적화
  라. 실험결과
  3. 2㎛ resolution plant cell 영상
  가. 시료 준비
  나. T1, T2 및 확산계수의 측정과 bandwidth의 최적화
  다. 실험결과
  4. Micro-structured silicon 구조의 영상화
  가. pulse sequence 및 parameter 최적화
  나. 획득한 영상
  5. 생쥐 난자 영상
  제4절 생쥐 두뇌 연구
  1. 연구방법 및 내용
  가. 간질에 동반되는 뇌의 구조적변화
  나. 전기적 해마 손상에 동반되는 행동 및 뇌구조 변화
  다. 화학적 해마 손상의 뇌영상화
  2. 연구결과
  가. 간질에 동반되는 뇌의 구조적변화
  나. 전기적 해마 손상에 동반되는 행동 및 뇌구조 변화
  다. 화학적 해마 손상의 뇌영상화
  제5절 발생연구 및 실시간 세포분석법 개발
  1. 실험 방법
  가. 섬유아세포의 준비 및 배양
  나. Oocyte 준비
  다. Microinjection - Oocyte
  라. 수정란의 발생과정분석
  마. 세포내 F-actin의 변화분석
  바. 세포내 Ca2+의 실시간분석
  사. 세포내 활성산소 (ROS) 실시간분석
  아. In situ Transglutaminase 활성도 분석
  자. Immunostaining
  차. ADP-ribosylation
  카. DPD 유전자의 cloning
  2. 연구내용
  가. Cell system 준비
  나. 발생과정연구
  (1) Oocyte