초록 ▼

1. 연구의 범위 가. 항바이러스제 내성기작 연구 나. 항암제 내성기작 연구2. 연구의 내용 가. 항바이러스제 내성기작 연구 항바이러스제 개발시 필수적으로 되어버린 약제내성 바이러스의 유도 분리와 관련 유전자의 돌연변이를 확인하는 연구체계 및 관련 기술 확립과 균주확보를 목적으로, 그동안 실험실의 세포배양체계에서 herpes simplex virus type 1 (HSV-1) strain F로 부터 유도분리한 9 개의 acyclovir (ACV) 내성균주의 동정을 계속하였다. 약제내성관련 유전자인 thymidine kinase (

1. 연구의 범위 가. 항바이러스제 내성기작 연구 나. 항암제 내성기작 연구2. 연구의 내용 가. 항바이러스제 내성기작 연구 항바이러스제 개발시 필수적으로 되어버린 약제내성 바이러스의 유도 분리와 관련 유전자의 돌연변이를 확인하는 연구체계 및 관련 기술 확립과 균주확보를 목적으로, 그동안 실험실의 세포배양체계에서 herpes simplex virus type 1 (HSV-1) strain F로 부터 유도분리한 9 개의 acyclovir (ACV) 내성균주의 동정을 계속하였다. 약제내성관련 유전자인 thymidine kinase (TK) deficient함이 밝혀진 이들 균주의 TK 유전자를 조사하여 TK 돌연변이가 항바이러스제 감수성 및 바이러스 증식기작에 끼치는 영향을 조사하였는데, 특히 동물 감염모델에서의 이용한 병원성 조사를 주요 연구내용으로 정하여 연구수행하였다. 세부적인 연구내용은 다음과 같다 : 1) 약제내성바이러스 vTK 유전자 염기서열조사 및 아미노산 서열 추정 및 western 분석, 2) 감염동물모델을 이용한 동정, 3) HSV-1 TK유전자 E.coli체계에서의 발현 및 TK단백질의 분리 정제 4) 항TK 다가항체 분리, 5) TK유전자 발현 진핵세포주 개발, 6) 새로운 내성바이스 분리. 나.항암제 내성기작 연구 일반적으로 악성 종양의 약제내성은 항암제를 사용함에 따라 증대되는 것으로 알려져 있으며, 이러한 약제내성 발현의 가장 대표적인 기전중의 하나가 7번 염색체에 위치하는 mdr1 유전자의 증폭과 이에 의해 coding되는 P-당단백은 약물과의 특이성(specificity)이 일반적인 물질운반 단백질들에 비해 매우 떨어지기 때문에 구조적 및 기능적으로 공통점이 없는 여러가지 종류의 약제들과 결합하여 세포밖으로 내보낼 수 있다. 따라서 항암제의 사용에 있어서 이러한 다제약제내성이 중요한 제한요소로 작용할 수 있으며, 임상적으로도 P-당단백을 발현하는 암을 갖는 환자의 치료율이 이를 발현하지 않는 암환자에 비해 현저히 떨어지는 결과를 보이고 있다. 따라서, 본 연구 과제인 항암제의 약제 내성 기전 연구는 약제 내성을 갖는 암세포를 새로이 분리하고, 그 기전에 대한 연구를 수행하여 궁급적으로 보다 좋은 항암제 및 다약제내성 억제제의 개발에 이용할 수 있도록 하는 것을 목표로 하였다.

Abstract ▼

This 3 year project of "studies on drug-resistant mechanisms of antiviral and anticancer" has been conducted with the following scope:1. Studies on antiviral drug-resistant mechanisms - Characterization by using cell-based assays - DNA sequence analysis of viral thymidine kinase (TK) gene - Characte

This 3 year project of "studies on drug-resistant mechanisms of antiviral and anticancer" has been conducted with the following scope:1. Studies on antiviral drug-resistant mechanisms - Characterization by using cell-based assays - DNA sequence analysis of viral thymidine kinase (TK) gene - Characterization by using infectious animal models - Expression of viral TK gene in E. coli - Isolation of anti-TK polyclonal antibody - Establishment of eukaryotic cell line expressing viral TK gene - Isolation of new drug resistant viruses2. Studies on drug-resistant mechanisms of anticancer cells - Establishment of drug-resistant cells - Multidrug resistant mechanisms of the established cells - Development of multidrug resistance reversal agents - Transplantation of human cancer cells in nude mouse

목차 Contents

• 제 1 장 항바이러스제 내성기작 연구...29
• 제 1 절 서론...29
• 제 2 절 국내외 기술개발 현황...32
• 제 3 절 연구개발수행 내용 및 결과...34
• 1. 연구수행내용...34
• 가. 세포배양체계를 이용한 동정...34
• 나. DNA 염기서열결정...35
• 다. 감염동물모델을 이용한 동정...35
• 라. E. coli체계에서의 TK유전자 발현...36
• 마. 항TK다가혈청 분리...36
• 바. TK유전자발현 세포주 개발...36
• 사. 새로운 내성바이러스 분리...37
• 2. 실험재료 및 방법...37
• 가. 실험재료...37
• (1) 세포...37
• (2) 바이러스...37
• (3) 박테리아...38
• (4) 시험동물...38
• (5) plasmid DNAs...38
• (6) 시험약물...38
• 나. 실험방법...38
• (1) 세포배양...38
• (2) 바이러스의 증식...40
• (3) 바이러스 역가측정...40
• (4) 항바이러스약효검색...40
• (5) 세포독성검색...41
• (6) MTT검색법...41
• (7) 단백질정량...42
• (8) 단백질 염색...42
• (9) TK 단백질의 Western 분석...43
• (10) E. coli체계에서 TK유전자 발현...43
• (11) TK 분리 정제...43
• (12) 다가항체 분리...44
• (13) Thymidine kinase 활성측정...44
• (14) 유전자 조작...45
• (15) 바이러스 DNA분리...45
• (16) Herpes simplex virus의 DNA의 PCR 증폭...45
• (17) DNA 염기서열 결정...46
• (18) Herpes simplex virus의 DNA 클로닝...46
• (19) 바이러스 TK유전자 발현 진핵세포주 개발...46
• (20) Herpes simplex virus의 동물피부감염모델...46
• (21) Herpes simplex virus의 mouse비강감염모델...48
• (22) 마우스의 대뇌감염...48
• (23) In vivo 약물투여효과...48
• (24) 약제내성바이러스의 유도 분리...48
• 3. 연구수행결과...50
• 가. 세포배양체계를 이용한 동정...50
• (1) Western 분석...50
• (2) Mouse유래 세포주에서의 바이러스역가...50
• (3) 항바이러스제 감수활성...52
• 나. DNA 염기서열결정...54
• (1) TK유전자 클로닝...54
• (2) Strain F와 CL101과의 TK염기서열 비교...54
• (3) Strain F와 내성바이러스들과의 TK염기서열 비교...57
• 다. 감염동물모델을 이용한 동정...61
• (1) 내성바이러스의 병원성연구...61
• (가) 생쥐 피부감염모델...61
• (나) 생쥐 비강감염모델...65
• (다) 생쥐 대뇌감염모델...70
• (2) ACV에 대한 감수성조사...77
• 라. E. coli체계에서의 TK유전자 발현...86
• (1) E. coli에서의 TK유전자 발현...86
• (2) TK의 분리정제...88
• 마. 항 HSV TK다가혈청 분리...88
• 바. TK유전자발현 세포주 개발...91
• (1) TK유전자발현 143B 유래 143FTK세포주 개발...91
• (2) 143FTK세포주를 이용한 항바이러스약효검색...93
• 사. 새로운 내성바이러스 분리...97
• (1) 내성바이러스 분리...97
• (2) 항바이러스제에 대한 감수성?도...106
• 제 5 절 연구개발 결과의 활용계획...107
• 제 6 절 참고문헌...108
• 제 2 장 항암제 내성기작 연구...114
• 제 1 절 서론...114
• 제 2 절 국내외 기술개발 현황...118
• 제 3 절 연구개발수행 내용 및 결과...121
• 1. 연구개발 내용 및 범위...121
• 가. 다약제내성 세포주의 개발 및 암세포주의 배양...121
• 나. 세포독성 실험...121
• 다. 세포내 약물축적 실험...121
• 라. 다약제내성 억제제의 심장순환계 부작용 실험...122
• 마. HCT15/CL02 세포의 nude mouse 이식...122
• 2. 연구개발 방법...123
• 가. 다약제내성세포주의 개발 및 암세포주의 배양...123
• 나. 세포독성 실험...124
• 다. 다약제내성 억제효과 실험...124
• 라. 세포내 약물축적 실험...124
• 마. 순환기 조절 평가 기술...125
• 바. HCT15/CL02 세포의 nude mouse 이식...127
• 3. 연구결과 및 고찰...128
• 가. 다약제내성 세포의 확립...128
• 나. HCT15/CL02 세포의 약제내성 기작 연구...130
• 다. 다약제내성 억제제의 개발...142
• 라. HCT15/CL02 다약제내성 세포를 포함한 인체유래 암세포주의 nude mouse 이식...161
• 제 4 절 연구개발 목표 달성도 및 대외기여도...164
• 1. 1 차 연도 연구개발...164
• 2. 2 차 연도 연구개발...165
• 3. 3 차 연도 연구개발...166
• 4. 발표논문...167
• 제 5 절 연구개발 결과의 활용계획...169
• 1. 연구개발의 향후 연구 필요성...169
• 2. 연구결과의 응용...170
• 제 6 절 참고문헌...172