초록 ▼

간세포 구상체 배양 관련 기술을 개발하고 이를 이용하여 말기 간부전 환자의 간기능 보조장치인 생인공간 시스템을 개발하였다.
생인공간의 세포원으로 사용할 목적으로 간세포를 부유 배양하여 구상체를 형성하였다. 무혈청 배지 조건에서 2$\~$3일 경과 후 170$\~$240um 크기의 구상체가 형성되었으며, 주사전자현미경 사진 관찰 결과 체내 간세포에서 발견되는 담즙세관(bile canaliculi)이나 동양 혈관(sinusoide)과유사한 구조로 판단되는 단층배양에서는 볼 수 없는 3차원

간세포 구상체 배양 관련 기술을 개발하고 이를 이용하여 말기 간부전 환자의 간기능 보조장치인 생인공간 시스템을 개발하였다.
생인공간의 세포원으로 사용할 목적으로 간세포를 부유 배양하여 구상체를 형성하였다. 무혈청 배지 조건에서 2$\~$3일 경과 후 170$\~$240um 크기의 구상체가 형성되었으며, 주사전자현미경 사진 관찰 결과 체내 간세포에서 발견되는 담즙세관(bile canaliculi)이나 동양 혈관(sinusoide)과유사한 구조로 판단되는 단층배양에서는 볼 수 없는 3차원 구조가 관찰되었고, 간 특이 기능을 확인한 결과 단층 배양의 경우 보다 전반적으로 우수한 활성을 나타내었으나, 본 실험 조건에서는 산소 결핍 및 교반에 따른 전단력으로 인하여 간기능 활성이 다소 빨리 감소된 것으로 판단된다.
간세포 구상체의 크기를 최적화하기 위하여 부유 배양 시간을 달리하여 얻은 다양한 웅집정도를 가지는 간세포 구상체를 칼슘-알지네이트 비드와 콜라젠 젤에 고정화하여 간기능을 확인하였다. 그 결과 20-24시간 교반으로 얻어진 직경 75$\pm$28um 크기의 쥐 및 돼지 간세포 구상체가 가장 높은 간기능 활성을 나타내어 생인공간의 세포원으로 가장 적합한 것으로 나타났다. 콜라젠 비드 충진형 생인공간(collagen bead-bioartificialliver, CB-BAL) 시스템과 폴리우레탄 충진형 생인공간(polyurethane foam bioartificial liver, PUF-BAL) 시스템을 제조하여 체외 성능를 비교한 결과, CB-BAL의 알부민 분비량이 PUF-BAL 보다 높게 유지되었다. 알부민 분비량의 이러한 증대 효과는 정치 상태의 콜라젠 젤에서도 확인되었던 결과로서 콜라젠과 같은 ECM 성분이 간세포의 특이 기능을 오래 유지시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 간세포반응기에 적용하기 위한 고정화 기술로 키토산과 알지네이트를 이용한 켑슐화 기술을 개발하였다. chitosan의 양전하와 alginate의 음전하 사이의 정전기적 반응에 의해 켑슐이 제조 되어졌고 켑슐은 적절한 켑슐 강도와 알부민에 대한 투과도를 유지하였다. 간세포와 pH 6의 chitosan용액과 혼합하는 켑슐 제조공정의 초기 단계에서 다소 생존율이 감소하였으나 전체적으로는 10％내로 간세포에 대해 안정함을 확인하였다. 간세포를 collagen을 첨가하여 켑슐화 시킨 결과, collagen을 첨가하지 않은 경우에 비해 높은 생존율 및 활성을 보였다. 3분간의 키토산-알지네이트 켑슐화 공정이 적당한 막 두께, 가장 높은 간기능 활성과 물질전달에 제약을 덜 받는 것으로 판단되며 24시간동안 간세포 구상체를 형성하여 캡슐화 하였을 때 적당한 세포간의 접촉정도와 물질전달이 이루어져 최적의 간세포 활성을 나타내는 것으로 판단된다. 인공간에 적용하기 위해서는 reactor 내에 충진되는 capsule의 부피를 최소화할 필요가 있는데 키토산-알지네이트 켑슐의 경우 9.0{\times}$10^6$cells/mL의 농도에서는 높은 간세포의 활성을 나타내었다.
최적화 된 키토산-알지네이트 켑슐을 충진한 packed-bed reactor를 장착한 생인공간 시스템에서 간기능 활성을 비교한 결과, 암모니아 제거능은 배양 5일경까지 다소 감소하였으나 이후 계속적으로 50％이상의 활성을 나타내었으며 요소 분비량을 배양 10일 경까지 완만한 감소로 높게 유지되었다. 실제 생인공간에 충진된 간세포는 간부전 환자의 혈장과 접하게 되므로 이에 대한 정보를 얻고자 간세포 단층과 구상체를 소혈청으로 배양하였다. 혈청은 합성 배지 보다 배양 형태에 상관없이 간기능을 심하게 저해하였으나 이에 대한 저항성은 단층보다는 간세포 구상체가 강하여 단층 보다 높은 간기능을 오래 유지하여 생인공간에 적합한 배양법임을 다시 한번 확인하였다.
쥐 in vivo 성능 평가를 위하여 약물을 이용한 쥐 간부전 모델과 혈장 분리 장치 및 간세포 반응기를 포함한 체외 순다. 경동맥과 경정맥을 연결하는 쥐 체외 순환 시스템은 혈액 유속 1.2ml/min, 혈장 분리 유속은 0.25ml/min 이며 혈압과 혈당을 유지할 수 있도록 하였다. 간세포 반응기는 하루 동안의 부유배양을 통하여 얻어진 최적의 간세포 구상체를 칼슘-알지네이트 비드에 고정화하여 충진하여 제작하였다. 이러한 BAL 시스템을 간세포가 없는 칼슘-알지네이트비드가 충진된 시스템과 비교한 결과 BAL 시스템 처리 쥐의 혈중 암모니아 농도의 상승폭이 대조군에 비하여 적었으며 분리된 혈장에 포함된암모니아가 효과적으로 제거되는 것을 확인하였다.
돼지 in vivo 성능평가를 위한 준비로서 대량의 간세포를 얻기 위하여 돼지의 전체간을 관류하여 간세포를 분리하였다. 인공심폐기를 이용하여 관류 용액에 충분한 산소를 공급하고 온도를 조절하고 관류 용액의 유속을 400 ml/min 이상을 유지한 결과 문헌에 보고된 최고의 돼지 간세포수율 및 생존율과 비슷한 수준으로 분리되었다. 분리된 간세포는 oxygenation 장치가 부착된 4 L 용량의 spinner vessel에서 배양 부피 3.5 L로 $5{\times}10^9$개를 하루 동안 부유 배양하여 구상체를 형성하였다. 구상체는 다시 칼슘-알지네이트 비드 내에 고정화하였으며 쥐에서 사용하였던 형태를 약 100배 scale-up한 반응기에 충진하여 사용하였다. 돼지의 간부전 모델은 문맥하대정맥 문합술을 이용하여 혈류가간을 우회하도록 하는 방법으로 유도하였고 혈장 분리는 인체 혈장 교환 치료에 사용되는 원심분리형 혈장 분리 장치를 사용하였다. 이와 같이혈장분리 속도 40ml/min, 반응기 순환 400ml/min으로 운전되는 돼지 및 임상시험도 가능한 BAL 시스템을 제작하였으며 연구비 규모상 세포 없는 경우와 간세포 구상체를 충진한 경우 각각 1회 실시하였다.
각종 간기능 지표가 세포 없는 BAL과 비교하여 간세포 구상체를 충진한 경우에 쥐의 경우에서처럼 개선되는 경향을 보이지는 못하였는데 그 원인을 분석한 결과 장시간의 켑슐화 과정으로 인하여 저산소 상태에서 장시간 방치되어 생존도 및 간기능이 크게 손상되었던 것으로 판단되었다.
원활한 돼지 in vivo 성능평가를 위해서는 대용량의 부유배양 장치와 켑슐화 장치가 추가로 개선되어야 할 것으로 사료된다.

Abstract ▼

Hepatocyte spheroid culture techniques were developed to obtain the optimum cell source of a bio artificial liver (BAL) that acts as a bridge device for the patient with liver failure until a donor organ becomes available for the transplantation or until the own liver can be regenerated.
Hepatoc

Hepatocyte spheroid culture techniques were developed to obtain the optimum cell source of a bio artificial liver (BAL) that acts as a bridge device for the patient with liver failure until a donor organ becomes available for the transplantation or until the own liver can be regenerated.
Hepatocyte multicellular aggregates, or spheroids were formed by a suspension culture using simple spinner vessels. Spheroids with 170-240 um size and round outline were formed within two or three days of culture. Bile canaliculi like structure was formed on the surface of spheroids. Hepatocyte spheroids showed slightly enhanced liver-specific functions and more differentiated morphology of cells compared to hepatocytes cultured in monolayers. In spinner vessels only with surface aeration, hepatocytes were subjected to hypoxia condition due to their high oxygen consumption rate and constant shearca used by agitation deteriorated the condition spheroids gradually by the culture period. Spheroid culture of hepatocytes in spinner vessels offers a simple and effective method of large-scale formation of spheroids.
To optimize the size of hepatocyte spheroids, rat and porcine hepatocyte aggregates with various degree of aggregation (DA) were obtained by controlling the suspension periods (0, 9, 24, and 48 hrs). The hepatocyte aggregates entrapped in model materialsof encapsulation such as Ca-alginate and type-Ⅰ collagen gels were prepared. The effects of DA on liver-specific functions of hepatocyte were evaluated for optimum DA of porcine hepatocytes as the cell source of BAL systems. Irregular rugged aggregates (size 75$\pm$28 um) formed by 24 hrs suspension culture showed high viability and hepatic functions such as ammonia removal and albumin secretion in the two types of entrapment systems. Thus, hepatocyte aggregates prepared from 24 hrs of suspension culture could offer a stable cell source of BAL system in the aspects of hepatic functions and convenience of scale-up.
Hepatocyte spheroids were immobilized by collagen gel bead formation techniques to scale-up collagen gel culture system. First, hepatocyte spheroids were suspended in collagen solution containing calcium chloride and then dropped into alginat solution. A thin layer of calcium alginate was formed around the droplet and then the inner collagen was gelled by the treatment of sodium citrate buffer. Spheroids embedded in collagen-gel bead maintained liver specific functions such as albumin secretion rate longer than hepatocyte spheroids exposed to shear stress. Therefore, this immobilization technique could offer an effective long-term hepatocyte culture method and facilitate the development of a bio artificial liver system.
Hepatocyte spheroids immobilized in collagen bead were packed in bioreactor (CB-BAL)and in vitro liver specific functions were compared to polyurethane foam-packed BAL (PUF-BAL) system of Kyushu Univ. CB-BAL showed more stable albumin secretion rate than PUF-BALChitosan-alginate capsules were formed by the electrostatic interactions and have an appropriate mechanical strength,permeability to albumin and stability to hepatocyte. Hepatocytes and hepatocyte spheroids were immobilized in chitosan-alginate capsules. Afterencapsulation, there was a 10％ decrease in the viability of spheroids due to the exposure of the cells to a pH 6 during theencapsulation process. Hepatocytes in collagen containing capsule maintained better viability and liver specific functions thanthose in the caosyke without collagen. Encapsulation process in 3 minutes and spheroid formation period of 24 hours wereoptimum condition for the best liver functions. Pig hepatocytes with cell density of $9.0{\times}10^6$ cells/mL in capsuleswere suitable for the application to bioartificial liver support system. Encapsulated pig hepatocytes spheroids showedstable ammonia removal and urea secretion rates in bioreactor for 2 weeks. It can be concluded that encapsulatedhepatocytes spheroids with chitosan-alginate in packed-bed bioreactor has a potential as a bioartificial liver. For rat invivo performance test of BAL system, acute liver failure of rat was induced by the injection of 1.5 g D-galactosamine/kg b.w. Ratextracorporeal circulation system consisting of plasma separation unit with 1.2 ml/min of blood flow and 0.25 ml/min plasmaseparation rate was established and used for BAL performance test. BAL system packed with Ca-alginate immobilizedhepatocyte spheroids removed efficiently ammonia from plasma of hepatic failured ratsLarge amount of porcine hepatocytes could be harvested by whole liver perfusion with a high yield and cell viability using high flowrate perfusion with oxygen saturated perfusion solutions. The hepatocytes were cultured to form spheroids using bioreactor thatequipped with oxygenator. The hepatocyte spheroids formed after 24 hrs of suspension culture were entrapped in Ca-alginatebead and packed in scale-up bioreactor for pig in vivo test. Unhepatic pig model was established using end-to-sideprotacabal shunt (PCS) and continuous plasma separation was performed by plasma pheresis system (Cobe Spectra,Gambro BTC)BAL systems with and without hepatocyte spheroids were connected to unhepatic pigs and performance of the BAL system wasevaluated. Any function indices were not improved at hepatocyte containing BAL system. The results caused by low functionalactivities of immobilized hepatocytes that already damaged by hypoxia conditions during long encapsulation processes.Therefore, large scale encapsulation system has been improved for the low functional loss of hepatocyte spheroids.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• Ⅰ. 연구개발결과 요약문...7
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 (한글)...7
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 (영문)...9
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...11
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...11
• 1-1. 연구목적...11
• 1-2. 연구현황...13
• 1-3. 현 생인공간 시스템의 한계...18
• 1-4. 연차별 연구개발 추진계획...19
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...20
• 2-1. 연구 재료 및 방법...20
• 2-1-1. 일차 간세포 분리...20
• 2-1-1-1. 쥐 일차 간세포 분리...20
• 2-1-1-2. 돼지 간 부분 관류에 의한 간세포 분리...20
• 2-1-1-3. 돼지 간 전체 관류에 의한 간세포 분리...21
• 2-1-2-. 간세포 단층 배양...21
• 2-1-3-. 간세포 구상체 배양...22
• 2-1-3-1. 교반 배양에 의한 간세포 구상체 형성...22
• 2-1-3-2. 간세포 구상체의 크기 및 농도 측정...22
• 2-1-4. 폴리우레탄 폼의 제조 및 생인공간 반응기...22
• 2-1-4-1. 폴리우레탄 폼의 제조 및 사용...22
• 2-1-4-2. 체외 성능 평가용 폴리우레탄을 이용한 생인공간 반응기...23
• 2-1-5. 콜라젠 비드를 이용한 간세포의 고정화 및 생인공간 반응기...24
• 2-1-5-1. 콜라젠 비드 고정화...24
• 2-1-5-2. 체외 성능 평가용 콜라젠 비드를 이용한 생인공간 반응기...25
• 2-1-6. 칼슘-알지네이트 비드 고정화...25
• 2-1-7. 키토산-알지네이트 켑슐 고정화...25
• 2-1-7-1. 켑슐 강도 측정...26
• 2-1-7-2. 켑슐 투과도 측정...26
• 2-1-7-3. 키토산-알지네이트 켑슐화 단계에 따른 세포생존율...26
• 2-1-7-4. 간세포 구상체의 키토산-알지네이트 켑슐화...26
• 2-1-7-5. 키토산-알지네이트 켑슐화 최적화...27
• 2-1-7-6. 키토산-알지네이트 켑슐화를 이용한 생인공간 반응기...28
• 2-1-8. 쥐 in vivo 성능 평가...28
• 2-1-8-1. 약물을 이용한 쥐 간부전 유도...28
• 2-1-8-2. 체외 혈액 순환...29
• 2-1-8-3. 혈장 분리 조건...29
• 2-1-8-4. 쥐 in vivo 성능 평가용 체외 순환형 생인공간 시스템...29
• 2-1-8-4-1. 혈압의 유지...29
• 2-1-8-4-2. 혈당의 유지...30
• 2-1-9. 돼지 in vivo 성능 평가...30
• 2-1-9-1. 돼지 간 전체 관류에 의한 간세포 분리...30
• 2-1-9-2. 돼지 간부전 모델...30
• 2-1-9-3. 돼지 in vivo 성능 평가용 생인공간 시스템 제작...30
• 2-1-10. 간기능 및 생존도 분석...31
• 2-1-10-1. 암모니아 농도 측정...31
• 2-1-10-2. 요소 농도 측정...31
• 2-1-10-3. 알부민 농도 측정...31
• 2-1-10-4. 간세포 생존도 측정...32
• 2-1-10-5. 혈액 분석...32
• 2-2. 결과...33
• 2-2-1. 일차 간세포 분리...33
• 2-2-1-1. 쥐 간으로 부터 간세포 분리...33
• 2-2-1-2. 돼지 간으로 부터 간세포 분리...33
• 2-2-2. 간세포의 단층 및 구상체 배양...33
• 2-2-2-1. 교반용기를 이용한 쥐 간세포 구상체 배양...33
• 2-2-2-2. 단층 및 구상체 배양 시스템의 세포 형태 변화...34
• 2-2-2-3. 구상체의 SEM(scanning electron microscope)에 의한 관찰...37
• 2-2-2-4. 간 특이 기능의 활성도 확인...38
• 2-2-3. 구상체 크기 최적화 및 고정화...40
• 2-2-3-1. 쥐 간세포 구상체들의 형태에 따른 고정화...41
• 2-2-3-2. 고정화된 간세포 응집체들의 간기능 활성...44
• 2-2-3-3. 고정화된 간세포 구상체들의 생존도...46
• 2-2-3-4. 돼지 간세포 구상체 고정화의 최적화...47
• 2-2-4. 콜라젠 비드 및 폴리우레탄 생인공간의 체외 성능 평가...50
• 2-2-5. 키토산-알지네이트 켑슐화...52
• 2-2-5-1. 캡슐 강도 측정...52
• 2-2-5-2. 켑슐 투과도 측정...53
• 2-2-5-3. 키토산-알지네이트 켑슐화 단계에 따른 세포생존율...54
• 2-2-5-4. 키토산-알지네이트 켑슐화 최적화...55
• 2-2-5-5. 키토산-알지네이트 켑슐화를 이용한 생인공간의 체외 성능 평가...62
• 2-2-6. 혈청에 대한 간세포 단층 및 구상체의 저항성...62
• 2-2-6-1. 혈청으로 배양된 간세포의 형태...63
• 2-2-6-2. 혈청으로 배양된 간세포의 간기능 활성...64
• 2-2-7. 쥐 in vivo 성능 평가...66
• 2-2-7-1. 간부전 모델 개발...66
• 2-2-7-2. 체외 혈액 순환 및 혈장 분리 조건...70
• 2-2-7-3. 쥐 in vivo 성능 평가용 체외 순환형 생인공간 시스템...70
• 2-2-7-4. 쥐 생인공간 in vivo 성능 평가 순서...73
• 2-2-7-5. 쥐 in vivo 성능 평가 결과...74
• 2-2-8. 돼지 in vivo 성능 평가...80
• 2-2-8-1. 대동물 in vivo 성능 평가를 위한 생인공간 시스템 제작...80
• 2-2-8-2. 돼지 간 전체 관류에 의한 간세포 분리...81
• 2-2-8-3. 돼지 간세포의 구상체 배양 및 반응기 제작...82
• 2-2-8-4. 돼지 간부전 모델...83
• 2-2-8-5. 돼지 in vivo 성능 평가용 생인공간 시스템 제작...84
• 2-2-8-6. 돼지 in vivo 성능 평가용 생인공간 시스템 성능 평가...86
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...88
• 3-1. 연구결과의 고찰...88
• 3-2. 결론...89
• 3-3. 연구 결과의 중요성 및 기대 효과...91
• 3-4. 향후 전망 및 과제...93
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...94
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...96
• 6. 첨부서류...96
• Ⅲ. 세부연구개발과제 연구결과...108
• 1. 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...109
• 2. 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...109
• 3. 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...109
• 4. 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...109
• 5. 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...109
• 6. 세부연구개발과제의 활용계획...109
• 7. 참고문헌...110