초록 ▼

본 연구는 다양하고 유용한 FISH probe를 개발하고, 이를 임상진단에 적용하여 그 유용성을 입증하며, 개발된 FISH probe를 제품화 할 수 있도록 전단계의 연구를 수행하기 위해서 시행되었다. 지금까지 유전질환의 진단을 위해서 이용되는 probe는 1) 특정부위의 진단을 위해서 이용되는 locus specific probe 2) 계수를 목적으로 이용되는 centromeric probe 3) 모든 염색체의 전체를 염색하여 염색체 이상을 확인할 수 있는 whole chromosome 또는 chromosomal region pa

본 연구는 다양하고 유용한 FISH probe를 개발하고, 이를 임상진단에 적용하여 그 유용성을 입증하며, 개발된 FISH probe를 제품화 할 수 있도록 전단계의 연구를 수행하기 위해서 시행되었다. 지금까지 유전질환의 진단을 위해서 이용되는 probe는 1) 특정부위의 진단을 위해서 이용되는 locus specific probe 2) 계수를 목적으로 이용되는 centromeric probe 3) 모든 염색체의 전체를 염색하여 염색체 이상을 확인할 수 있는 whole chromosome 또는 chromosomal region painting probe로 구분할 수 있다. 따라서, 이러한 3가지 유형의 FISH probe를 개발하여 임상적으로 적용하였다. 첫 번째 과제는 세부과제 책임자가 이미 정립된 interphase FISH, metaphase FISH 및 hypermetaphase에 의해서 잔류병의 발견 및 정량의 우수성을 검증할 수 있었다. 또한 잔류병과 염색체 소견과의 연관을 얻어낼 수 있었으며, 이는 future clinical trial에 중요한 자료가 되었다. 즉 잔류병이 많은 군에서는 보다 강력한 치료와 면역 증진 치료를 겸해야 하는 치료의 방향을 제시하였으며, ERK dysregulation의 정도와 염색체 이상에 따른 예후 인자들을 연계시키는 것을 앞으로 더 연구가 필요하다. 이는 EH한 specific targeting therapy에 중요한 자료를 제공할 것이다. 두 번째 과제는 전체염색체를 중기관정에서 구별할 수 있는 painting probe 개발을 위해 실행되었다. 방법을 간단히 소개하면, 림프구로부터 9, 10, 11, 12 번 염색체를 준비하고 각 염색체를 미세조작기를 이용하여 미세절편한 후 20-30개의 염색체를 각각 미세관에 오염되지 않도록 주의하면서 획득하고 이렇게 얻은 염색체 절편들은 chromosomal specific library를 얻기 위해 DOP-PCR을 통해 증폭한다. painting probe를 제작하기 위해서는 PCR으로 biotin-16-dUTP로 labelling한 후 normal metaphase slide에 in situ hybridization 하였다. Texas Red-Avidin으로 1차 처리한 후 signal을 증폭하기 위해서 biotinylated-anti-Avidin을 binding 시킨 후 Texas Red-Avidin으로 2차 detection하였다. 확인된 FISH signal은 cytovision (Applied image, UK)을 이용하여 capture하여 분석하였다. acrocentric chromosome인 13, 14, 15, 21, 22번 염색체 및 X, Y 염색체는 human-rodent hybrid cell line으로부터 DNA를 추출하였다. 여기에서 추출한 DNA를 Alu primer을 이용하여 PCR 반응으로 human DNA 만을 증폭하였다. 이렇게 얻어진 human chromosome specific DNA를 nucleotide labelling kit을 이용하여 flurochrome을 labelling하였다. FISH를 위해서 probe 10μl를 75℃에서 5분간 denaturation한 후 37℃에서 1시간 prehybridization한 후에 역시 denature 된 normal metaphase 슬라이드에 접합시켰다. 37℃에서 24시간 배양한 후 슬라이드를 washing하고 DAPI로 counter staining하여 형광현미경을 이용해서 signal을 확인하였고, 확인된 FISH signal은 컴퓨터분석기를 이용하여 영상을 분석하였다. 이상의 연구를 통해서 모든 종류의 whole painting probe (WCP)를 확보할 수 있게 되었으며 임상적으로 적용하여 좋은 결과를 얻었다. 따라서, chromosome specific library에 대한 순수도와 specificity를 향상시켜서 실용화가 가능할 것으로 사료되며 제품화를 위한 지속적인 연구와 지원이 이루어져? FISH probe를 개발하기 위해 시행되었다. 염색체 계수용 FISH probe를 개발하기 위해서는 G-band 염색체 표본에서 1, 6, 9, 10, 11, 13, 15, 18, 21, X, Y 염색체를 미세조작기를 이용하여 현미경 시야에서 centromeric region을 미세절편한다. 절편되는 염색체의 양이 적기 때문에 각 염색체 당 30-50개의 절편을 획득하였으며 DOP-PCR을 통하여 증폭하였고, 이렇게 얻어진 DNA를 통해서 PCR chromosome library를 획득하였다. 응축된 염색체 DNA와 내외적인 오염원을 제거하였으며 FISH probe를 만들기 위해 biotinylation 과정을 시행하였다. 이렇게 만들어진 probe는 임상적으로 이용하기 위해서 정상적인 염색체 표본을 통해서 FISH를 시행하여 효용성을 검증하였으며 기존의 제품과 동일한 기능을 나타내는 DNA library는 microcloning을 시행하였다. 이와 같은 미세조작술은 정확하게 반복적인 부위를 검출할 수 없고 충분한 양의 DNA를 확보할 수 없다는 어려움이 있어서 본 과제 책임자는 새로운 기술은 Laser Microbeam을 이용한 미세절편술을 시행하였다. 이 방법은 Laser Microscope (PALM, Co.)을 통해 염색체를 원하는 부위는 절편할 수 있으며 또한 신속하게 처리함으로써 오염을 방지하고 많은 양의 염색체 절편을 획득할 수 있는 장점을 가지고 있다. 1-22, X, Y 염색체의 centromeric specific region에서 염색체절편을 획득하여 시행하였다. 획득된 절편은 앞서와 마찬가지로 DOP-PCR을 통하여 증폭하여 chromosome library를 획득하였고 여기에 biotin을 첨가하여 PCR을 이용하여 fluorochrome labelling을 하였다. 정상환자의 염색체 표본에서 FISH를 시행하여 컴퓨터 분석기 (cytovision, applied image, UK)을 이용하여 영상을 분석하였고 이렇게 분석된 FISH 결과에서 유용성이 입증되는 PCR product는 반복적인 실험을통해 specifity와 region을 확인하고 유용성이 낮은 산물들은 처음부터 다시 반복적인 실험을 통해서 계속해서 실험하였다. 이상의 방법을 통해 1, 7, 8, 11, 12, 18, 21번의 염색체에서 기존의 상품과 대등한 효과를 나타내는 probe를 개발 할 수 있었으며 비록 유용성과 효율성은 떨어지나 다른 염색체들도 가능성을 제시하였다. 임상적으로는 착상적 유전자 진단을 시행하여 효율성을 확인하였으나 워낙 적은 수의 배아를 이용하는 실험이므로 보다 높은 정확성과 specificity가 요구됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 과제를 통해서 계수용 FISH-Probe를 개발할 수 있었으며 이러한 방법론이 구축됨에 따라 유전질환에서 염색체 진단을 위해 필요한 probe의 개발은 용이할 수 있을 것으로 사료되며 실용화 단계를 거쳐 제품화가 가능하리라고 사료된다. 네 번째 과제는 염색체의 말단부(telomere)의 이상이 있는 경우를 진단하기 위해서 Telomere PRINS kit의 개발과 산전진단을 위한 Multicolor FISH probe의 개발을 위해서 시행되었다. 최근에 개발된 PRINS (PRimed IN Situ labelling)법은 FISH법 보다 간단한 과정을 거쳐 염색체의 특정부위를 확인할 수 있는 방법이다. PNINS를 이용한 telomere 부분의 염색을 위해서 (CCCTAA)??? 을 primer로 사용하여 개발하고 개발된 telomere PRINS kit는 임상적으로 정상인의 말초혈액 배양으로 얻어진 염색체 슬라이드에서 46개의 염색체에 실시해서 모두의 말단 telomere 부분에서 형광 signal을 확인할 수 있었다. Multicolor probe의 개발은 제 2 세부 과제에서 제작된 단일 color WCP probe를 이용하여 제작하였다. 우선 two-color probe는 서로 다른 두 형광 dye (green과 red)로 표지된 두 개의 probe를 혼합한 후 동시에 한 장의 슬라이드에 in situ hyridization 시켰다. FISH signal은 두??합비율을 조정하였다. 이렇게 two-color-FISH를 시행한 후 11번 12번 염색체에 대해서 확인해본 결과 임상적으로 11번 염색체는 green으로 12번 염색체 probe는 red로 각각 표지한 후 공동접합시키고 형광현미경하에서 관찰한 결과 two-color-FISH image를 얻어서 유용성을 확인할 수 있었다. 또한 D-group 염책체는 13번 green, 14번 red, 15번 red와 green 두가지 형광 염색으로 동시에 labeling 한 후 이들 세 probe를 혼합해서 FISH를 시행하였다. 결과적으로 세가지 색깔의 형광 image를 얻을 수 있었다.

Abstract ▼

These projects were performed to development and put a practical using of fluorescence in situ hybridization (FISH) probe for clinical diagnosis in patients with genetic diseases. It is well known 3 kinds of FISH probe for genetic diagosis in patients with genetic diseases, one is locus specific pro

These projects were performed to development and put a practical using of fluorescence in situ hybridization (FISH) probe for clinical diagnosis in patients with genetic diseases. It is well known 3 kinds of FISH probe for genetic diagosis in patients with genetic diseases, one is locus specific probe which is for diagnosis of specific region or unknown region on chromosome, second is centromeric region probe which is for diagnosis of abonormality in number of chromosome, last whole painting probe which is for diagnosis of chromosomal abnormality. Therefore, we tried to establish the techniques and development 3 kinds of FISH probe and apply the clinical studies. First project was that we already established before have proved that the superiority of i-FISH, m-FISH and HMF(hypermetaphase FISH) on the remission samples in AML. This data will be the base to design the intensity of consolidation of AML treatment in the future clinical trials for each AML group based on cytogenetic risk. In addition, in depth investigation on correlation of ERK dysregulation and the residual disease based FISH will provide further insight to target the specific molecular defects of AML. Second project was carried out to development the whole painting probe for genetic diagnosis of chromosome abnormality. As explained the methods briefly, sample slide was prepared to metaphase chromosome from normal human lymphocytes. Microdissection of chromosome using micromanipulation was treated with 9, 10, 11, 12 chromosomes and we obtained with 20-30 copies of dissected chromosome in each chromosome. To have chromosomal specific library, DOP-PCR was performed in these samples. Bionylation was used to make painting probe using PCR procedures with biotin-16-dUTP and tried to FISH in normal metaphase slide. All of samples were assessed with observation of fluorescence signal of chromosome under the fluorescence microscopy and, finally, confirmed with cytovision. In order to obtain the extraction of DNA in 13, 14, 15, 21, 2, X, Y chromosomes, we used the human-rodent hybrid cell line. We obtained only human DNA using PCR with Alu primer (Alu-PCR). And, we tried to FISH in patients with genetic disease by using these FISH probe and obtained with successfully data. Also, there was no differences on signal effectiveness of chromosome between commercial probe and our probe. We proved the effectiveness of our probe in genetic diagnosis for clinical study. As a result, all kinds of FISH probe (WCP) were developmented through these techniques and we suggest that these probes were able to use for genetic diagnosis and try to make products of FISH probe for marketing of genetic diagnosis.
Third project was carried out ot development the centromeric probe for genetic diagnosis of number of chromosome abnormality. In order to get disseced chromosomal-DNA, we tried as same methods as second project using micromanipulation. But, it was not keeping with second project because we need to obtain a lot of chromosomal DNA, in this case, as different as whole painting probe. So, we had to try to solve the problem and another method, that is, laser microbeam microdissection (LMM; PALM, Co.). Microdissection of chromosome by LMM was performed with centromeric regin of 1-22, X, Y chromosomes and we obtained with 30-50 copies of dissected chromosome in each chromosome. To have chromosomal specific library, DOP-PCR was performed in these samples. Bionylation was biotin-16-dUTP and tried to FISH in normal metaphase slide. All of samples were assessed with observation of fluorescence signal of chromosome under the fluorescence microscopy and, finally, confirmed with Cytovision. For preimplantation genetic diagnosis (PGD), we tried to FISH in embryos from infertility patients and applied to clinical study in lymphocytes in infertility patient with translocation, also. The results of PGD was not satisfied, but successed in translocation patient. From our studies, we comfirmed the 7 probes (1, 7, 8, 11, 12, 18, 21 chromosome) and proved the effectiveness of our probe in genetic diagnosis for clinical study. Final project was performed to development telomere PRINS kit for genetic diagnosis of genetic disease with telomere abnormality and multicolor FISH probe for prenatal diagnosis. PRINS method showed recently is more convenient and effective that FISH. For staining of telomere and development of PRINS probe, we performed PCR using the primer of (CCCTAA)??? and PCR product tried to apply normal metaphase chromosome. In order to development Multicolor probe, we used the WCP painting donatd from 2rd project. Two different color (Green and Red) mixed probe was stained and put in situ hybridization simultaneously with unique slide. In this case, mixed rates of two-color probe is very important factor to have a good result and signal of FISH was depend on quantities of two-color probes. After FISH, we obtained that green color was 11 and red color was 12 chromosome under fluorescence microscopy. And, we confirmed this data by Cytovision and proved the effectiveness of two-color probe. We tried to three color-(green, red, red/green) FISH in normal metaphase chromosome and obtained the 3 kinds color of chromosome (13, red; 14, red; 15, green/red). As a result, ew developmented telomere PRINS kit and multicolor probe and proved clinical utility and effectiveness in patients with genetic diseases. We concluded as follows. 1) Whole painting probes were developmented 2) A part of centromeric region specific probes were confirmed and applied to clinical studies. 3) Telomere PRINS kit and multicolor probe were proved the effectiveness of our probe in genetic diagnosis for clinical study. Therefore, we think that all kinds of FISH probes developmented in these projects were able to use for genetic diagnosis and apply to improve the specificity and purity of these probes and finally, make products of FISH probe for marketing of genetic diagnosis.
Third project was carried out to development the centromeric probe for genetic diagnosis of number of chromosome abnormality. In order to get disseced chromosomal-DNA, we tried as same methods as second project using micromanipulation. But, it was not keeping with second project because we need to obtain a lot of chromosomal DNA, in this case, as different as whole painting probe. So, we had to try to solve the problem and another method, that is, laser microbeam microdissection (LMM; PALM, Co.). Microdissection of chromosome by LMM was performed with centromeric region of 1-22, X, Y chromosomes and we obtained with 30-50 copies of dissected chromosome in each chromosome. To have chromosomal specific library, DOP-PCR was performed in these samples. Bionylation was used to make cnetromeric region specific probe using PCR procedures with biotin-16-dUTP and tried to FISH in normal metaphase slide. All of samples were assessed with observation of fluorescence signal of chromosome under the fluorescence microscopy and, finally, confirmed with Cytovision. For preimplantation genetic diagnosis (PGD) , we tried to FISH in embryos from infertility patients and applied to clinical study in lymphocytes in infertility patient with translocation, also. The results of PGD was not satisfied, but successed in translocation patient. From our studies, we confirmed the 7 probes ( 1, 7, 8. 11, 12, 18, 21 chromosome) and proved the effectiveness of our probe in genetic diagnosis for clinical study. Final project was performed to development telomere PRINS kit for genetic diagnosis of genetic disease with telomere abnormality and multicolor FISH probe for prenatal diagnosis. PRINS method showed recently is more convenient and effective than FISH. For staining of telomere and development of PRINS probe, we performed PCR using the primer of (CCCTAAh and PCR product tried to apply normal metaphase chromosome. In order to development Multicolor probe, we used the WCP painting donated from 2rd project. Two different color (Green and Red) mixed probe was stained and put in situ hybridization simultaneously with unique slide. In this case, mixed rates of two-color probe is very important factor to have a good result and signal of FISH was depend on Quantities of tWo-color probes. After FISH, we obtained that green color was 11 and red color was 12 chromosome under fluorescence microscopy. And, we confirmed this data by Cytovision and proved the effectiveness of two-color probe. We tried to three color-(green, red, red/green) FISH in normal metaphase chromosome and obtained the 3 kinds color of chromosome (13, red; 14, red; 15, green/red ) As a result, we developmented telomere PRINS kit and multicolor probe and proved clinical utility and effectiveness in patients with genetic diseases. We concluded as follows. 1) Whole painting probes were developmented 2) A part of centromeric region specific probes were confinued and applied to clinical studies. 3) Telomere PRINS kit and muticolor probe were proved the effectiveness of our probe in genetic diagnosis for clinical study. Therefore, we think that all kinds of FISH probes developmented in these projects were able to use for genetic diagnosis and apply to improve the specificity and purity of these probes and finally, make products of FISH probe for marketing of genetic diagnosis.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 요약문 ... 5
• Summary ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 3.총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 24
• 4.총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 28
• 5.총괄연구개발과제의 활용계획 ... 34
• 6. 첨부서류 ... 35
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 53
• 1.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 54
• 2.제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 55
• 3.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 59
• 4.제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 63
• 5.제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 64
• 6.제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 68
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 69
• 1.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 70
• 2.제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 72
• 3.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 77
• 4.제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 80
• 5.제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 82
• 6.제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 83
• 7.참고문헌 ... 83
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 85
• 1.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 86
• 2.제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 88
• 3.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 91
• 4.제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 93
• 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 94
• 6.제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 95
• 7.참고문헌 ... 95
• 제4세부연구개발과제 연구결과 ... 97
• 1.제4세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 98
• 2.제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 100
• 3.제4세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 102
• 4.제4세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 105
• 5.제4세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 107
• 6.제4세부연구개발과제의 활용계획 ... 108
• 7.참고문헌 ... 108