초록 ▼

내열성 maltogenic amylase인 ThMA 유전자를 보유하고 있는 E. coli를 배양한 후 ThMA를 황산암모늄 분획법과 음이온교환수지 컬럼크로마토그라피를 이용하여 순수정제하였다. 또한, 정제효율을 높이기 위해 6개의 Histidine tag을 효소에 결합시켜 Ni-NTA 컬럼의 단일 단계로 순수정제하였다. 정제된 ThMA는 아카보스를 가수분해하여 acarviosine-glucose (PTS)와 포도당을 생산하였고 수용체가 존재할 때 당전이 산물을 생산하였다. 수용체로는 단당류, 이당류, 삼당류 등의 여러 가지 당을 사용

내열성 maltogenic amylase인 ThMA 유전자를 보유하고 있는 E. coli를 배양한 후 ThMA를 황산암모늄 분획법과 음이온교환수지 컬럼크로마토그라피를 이용하여 순수정제하였다. 또한, 정제효율을 높이기 위해 6개의 Histidine tag을 효소에 결합시켜 Ni-NTA 컬럼의 단일 단계로 순수정제하였다. 정제된 ThMA는 아카보스를 가수분해하여 acarviosine-glucose (PTS)와 포도당을 생산하였고 수용체가 존재할 때 당전이 산물을 생산하였다. 수용체로는 단당류, 이당류, 삼당류 등의 여러 가지 당을 사용할 수 있었으며, gentiobiose, cellobiose, glucose 등의 수율이 높게 나타났다. 당전이산물은 하나의 주산물과 여러개의 부산물이 생성되었으며 이것은 TLC나 HPIC로 확인할 수 있었다. Methylation analysis, 가수분해효소법으로 당전이 산물의 구조를 분석한 결과 주로 $\alpha$-(1,6)결합을 가지고 있었으며, $\alpha$-(1,3)나 $\alpha$-(1,4) 결합도 생성되었다. 아카보스 유도체인 PTS와 isoacarbose에 대한 전분가수분해효소 저해 효과를 실험한 결과 PTS는 제빵효모에서 유래한 $\alpha$-glucosidase와 CGTase에 그리고, isoacarbose는 porcine pancreatic $\alpha$-amylase에 강력한 저해효과를 나타내어 아카보스 유도체의 구조에 따라 효소저해 특이성이 변화함을 알 수 있었다.
Cyclodextrin을 분해하는 효소들의 구조와 기능 상관관계의 이해를 위해 ThMA와 이 효소 저해제인 G1PTS, 그리고 cyclomaltodextrinase (CDase)의 3차원 구조를 각각 규명하였다. ThMA는 dimer구조를 하고 있으며 N-terminal domain이 인접한 subunit의 (alpha/beta)-barrel domain과 서로 상호 작용하여 활성부위 cleft를 형성하였다. 이 dimer구조는 액상에서 equilibrium centrifugation과 size-exclusion column chromatography로 결정한 효소의 분자량과 일치하였다. G1PTS는 3개의 glucose ring과 1개의 pseudo glucose ring으로 구성되어 있으며 2번과 3번째 ring 사이가 N-glycosidic bond가 catalytic residues와 인접하도록 G1PTS가 결합한다는 것이다. G1PTS는 (alpha/beta)-barrel domain과 인접한 subunit의 N-terminal domain과도 서로 상호작용함으로서 효소의 dimerization이 기질에 대한 특이성을 결정해 준다는 사실을 뒷받침해준다.
CDase는 dodecamer인데 이의 building block은 ThMA와 같은 dimer임을 알 수 있다. 특이할 만한 사실은 dodecamerization에 의해 3개의 active site가 서로 인접한다는 것인데 이러한 공간적 배치는 기질을 효율적으로 maltose unit까지 분해하는데 도움이 될 수 있는데 실제로 dimer인 ThMA보다 CDase는 2-3배 높은 catalytic efficiency를 보인다. 즉 dodecamerization은 효소의 촉매효율을 높이도록 design된 것이라 할 수 있다. 상기한 연구 결과 특히 G1PTS와 결합하는 효소의 잔기들을 규명하였음으로 이 결과는 앞으로 분지올리고당 생성 수율을 높이는 효소의 분자설계에 기초적 자료를 제공할 수 있다.
ThMA의 반응에 의하여 생성된 acarbose 유도체인 PTS 및 isoacarbose의 혈당강하 효능을 단기간 및 장기간의 두 가지 측면에서 확인하였다. 단기간의 효능인 전분 부하 (1.0 g/kg B.W.)에 의한 식후 혈당 및 인슐린 상승 억제 효과에서는 PTS 및 isoacarbose는 각각 대조군에 비하여 유의적인 상승 억제 효과를 보이기는 하였지만 acarbose와의 효과 차이는 보이지 않았다. 당뇨 모델 동물인 ob/ob mice의 식이에 0.02%로 혼합하여 6주간 섭취시켰을 대 PTS 및 isoacarbose는 대조군에 비하여 유의적으로 혈당치와 glycosylated hemoglobin 비율을 저하시켰지만, acarbose와의 차이는 보이지 않았다. 다만 isoacarbose는 acarbose에 비하여 혈중 중성지방 함량을 높게 저하시켰다(45% vs. 20%).
이상의 결과로부터 탄수화물을 많이 섭취하는 우리나라 실정에 맞는 효과적인 혈당조절 탄수활물 신소재 개발, 당분해효소 저해능력이 높고 효소특이성이 우수한 새로운 효소저해 탄수화물 신소재 개발, 효소의 3차구조 분석 및 작용메카니즘 연구로 첨단 기초 기술 확보 등을 기대할 수 있다.

Abstract ▼

ThMA was purified by ammonium sulfate fractionation and anion exchange chromatography after culturing E. coli cells harboring the gene encoding ThMA, thermostable maltogenic amylase. To improve purification yield, ThMA was tagged with 6 histidine, which could be purified in one step using Ni-NTA co

ThMA was purified by ammonium sulfate fractionation and anion exchange chromatography after culturing E. coli cells harboring the gene encoding ThMA, thermostable maltogenic amylase. To improve purification yield, ThMA was tagged with 6 histidine, which could be purified in one step using Ni-NTA column chromatography. Acarbose was hydrolyzed to acarviosine-glucose(PTS) and glucose by the purified ThMA. Transglycosylated products of acarbose were also produced with the proper acceptor molecules by the enzyme. Various mono-, di-, and tri-saccharide could be used as acceptor molecules for the transglycosylation reaction, and among these, gentiobiose, cellobiose, and glucose were found to be best acceptor molecules. For the structure analysis of transfer products, methylation analysis or enzymatic hydrolysis method were applied and the results showed that the linkage between PTS and acceptor was $\alpha$-(1,6) mainly and some $\alpha$-(1,3) or $\alpha$-(1,4) linkage product was produced. Inhibition kinetic study for acarbose, PTS, and isoacarbose against $\alpha$-glucosidase from Bakers yeast, porcine pancreatic $\alpha$-amylase, and CGTase was carried out. PTS was a potent inhibitor for $\alpha$-glucosidase from Bakers yeast and CGTase, while isoacarbose was a good inhibitor for porcine pancreatic $\alpha$-amylase.
In order to begin to understand the structure-function relationship of cyclodextrin-hydrolyzing enzymes, the crystal structures of a maltogenic amylase from a Thermus species, the enzyme in complex with a competitive inhibitor G1PTS, and cyclomalto-dextrinase were determined. The structure of the maltogenic amylase is a dimer in which N-terminal domain of a subunit interacts with (alpha/beta) barrel domain of the other subunit. The dimeric structure was found to be the building block in the dodecameric structure of cyclomaltodextrinase. The active site is formed in such a way that the N-terminal domain constitutes the active site of the adjacent domain.
As a result the active site is narrow and deep compared with that of other small molecular weight alpha-amylases. The G1PTS bound to the active site interact with the both domains, the major interactions being provided by the (alpha/beta) barrel domain. The complex structure provides evidence that the substrates will also bound to the active site by interacting with the both domains, and that the dimerization is indeed a major theme in determining the specificity of the enzyme for cyclodextrins over starch materials. The structures provides the begining point for designing engineered enzymes that could exhibit increased production of branched oligosaccharides.
The in vivo effect of two acarbose derivatives, PTS and isoacarbose, was evaluated both by short-term and long-term studies. In the case of the short-term studies, the postprandial peak glucose levels and total incremental glucose following intubation of starch (1.0 g/kg B.W.) were simultaneously intubated. When PTS or isoacarbose (20 mg/kg diet) was fed in the diet of ob/ob mice for 6 weeks, the plasma glucose level and glycosylated hemoglobin were significantly lowered.
Based on the results, it is proposed that the acarbose derivatives should find uses as 1) novel carbohydrate materials controlling blood glucose level efficiently, 2) novel amylolytic enzyme inhibitors having potent inhibition properties and specificities.

목차 Contents

• 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...11
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...15
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...21
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...24
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...28
• 6. 첨부서류...28
• 제 1 세부연구개발과제 연구결과...73
• 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...75
• 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...76
• 3. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...80
• 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...99
• 5. 제 1 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...101
• 6. 제 1 세부연구개발과제의 활용계획...102
• 7. 참고문헌...103
• 제 2 세부연구개발과제 연구결과...105
• 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...107
• 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...108
• 3. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...109
• 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...114
• 5. 제 2 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...115
• 6. 제 2 세부연구개발과제의 활용계획...116
• 7. 참고문헌...117
• 제 3 세부연구개발과제 연구결과...119
• 1. 제 3 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...121
• 2. 제 3 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...122
• 3. 제 3 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...123
• 4. 제 3 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...135
• 5. 제 3 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...141
• 6. 제 3 세부연구개발과제의 활용계획...142
• 7. 참고문헌...142