초록 ▼

유전자치료제의 안전성 확보를 위한 연구의 일환으로 adenoviral vector에 암 억제유전자인 p16이 도입된 ad5CMV-p16 (100 moi)을p16유전자 결손 사람 폐암세포주인 A549에 감염시킨 후 유전자 및 단백질 발현변화를 조사하였다. 우선 ad5CMV-pl6 및 ad5CMV를 A549 세포에 도입시킨 후 유전자 발현을 조사하기 위하여 세포신호전달, 세포주기조절, 암 유전자, 암 억제유전자 cDNA 등이 들어있는 Macrogen CDNAchip, Mergen oligonucleotide chip 및 Super Ar

유전자치료제의 안전성 확보를 위한 연구의 일환으로 adenoviral vector에 암 억제유전자인 p16이 도입된 ad5CMV-p16 (100 moi)을p16유전자 결손 사람 폐암세포주인 A549에 감염시킨 후 유전자 및 단백질 발현변화를 조사하였다. 우선 ad5CMV-pl6 및 ad5CMV를 A549 세포에 도입시킨 후 유전자 발현을 조사하기 위하여 세포신호전달, 세포주기조절, 암 유전자, 암 억제유전자 cDNA 등이 들어있는 Macrogen CDNAchip, Mergen oligonucleotide chip 및 Super Array cDNA membrane을 이용하여 DNA microarray를 실시하였다. 그 결과 Macrogenc DNA chip에서 총 400개 유전자중 발현이 2배 이상 증가한 유전자는 17개로 나타났으며 2배 이상 감소한 유전자는 5개로 나타났다. Mergen oligonucleotide chip에서는 암 유전자 (103개), 암 억제유전자 (31개), 세포주기조절 (31개), apoptosis (90개), 세포내 신호전달과 관련된 protein kinase (19개), tumor necrosis factor (18개), cytokine 및 growth factor (152개) 등과 관련된 총 유전자 1152개에 대하여 조사한 결과 발현이 2배 이상 증가한 유전자는 17개였고 감소한 유전자는 10개로 나타났다. SuperArray cDNA membrane에서는 세포주기 조절에 관여하는 cyclin 등 총 23개 유전자중 세포증식과 관련된 5개 유전자 (cdc 2, cdk4, cyclin B, cyclin D3, cyclin E)들의 발현변화가 20-30%씩 감소하였고 특히 cdk2의 경우에는 2배 이상 감소하였다. 그러나 나머지 유전자 (cdk6, c-myc, cyclin A, cyclin C, cyclin D2, E2F, egr-1,mdm2, p19INK4d, gadd45, p53, p21waf1, p57Kip1, PCNA, Rb, skpl, skp2)들의 경우 발현변화는 없는 것으로 나타났다. 이들 유전자중 종양과 관련 있는 것으로 보이는 ras 관련 유전자는 향후 동물을 이용한 전임상 안전성 평가연구에서도 발현변화가 있는지에 대한 확인 및 암세포가 아닌 정상세포에서도 ad5CMV-pl6을 처리할 경우 유전자 발현변화가 있는지에 대해서도 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 그 다음 ad5CMV-pl6 및 ad5CMV를 A549 세포에 도입시킨 후 단백질 발현을 조사하기 위하여 이차원 전기영동을 실시한 결과 2배 이상 발현변화를 보인 단백질이 다량 검출되었으며, 이들 단백질들을 동정하기 위해 PDQuest 프로그램과 MALDI-TOF 분석을 진행하고 있다. 따라서 이들 결과를 종합해 볼 때 유전자치료제의 안전성평가에 있어서, 유전자도입으로 인해 치료용 유전자 이외 특정유전자가 발현되어 잠재적으로 숙주세포에 미칠 수 있는 독성평가 등이 고려되어야 한다고 사료된다

Abstract ▼

For the safety evaluation of adenovirus mediated gene therapy, we have investigated genes and proteins whose expressionsare changed after infection of ad5CMV-p16 (100 moi) in A549 human non-small cell lung cancer cells. First, wecompared the differential gene expression in both A549 cells treated wi

For the safety evaluation of adenovirus mediated gene therapy, we have investigated genes and proteins whose expressionsare changed after infection of ad5CMV-p16 (100 moi) in A549 human non-small cell lung cancer cells. First, wecompared the differential gene expression in both A549 cells treated with ad5CMV and ad5CMV-p16 virus, respectively, by usingthe three different DNA chips, Macrogen cDNA chip (400 genes) and Mergen oligonucleotide chip (1200 genes) which carrysgenes related with signal transduction pathways, cell cycle regulations, oncogenes and tumor suppressor genes and Super Array cDNA chip on which more than 26cDNA fragments from genes associated with a cell cycle regulations. We found that ad5CMV-p16 virus compare to ad5CMV up- or down-regulated 22 genes on Macrogen cDNA chip., 27 genes on Mergen oligonucleotide chip., two fold or more. We also found that ad5CMV-p16 virus down regulated 5 genes (cdc2, cyclin D3,cyclin B, cyclin E, cdk2) among 26 genes involved in cell cycle regulations from Super Array cDNA chip, 20% or more, but expressions of the other genes (c아6, c-myc, cyclin A, cyclin C, cyclin D2, E2F, p53, p21wafl, PCNA, Rb, etc) did not significantly affected by ad5CMV-p16 virus. N-ras related gene which was known to be involved in carcinogenesis was found toconfirm whether this gene overexpress in normal and tumor tissues using animal experiments by treatment of ad5CMV-p16 virus. Second, we have conducted two dimensional gel electrophoresis to detect any unexpected protein over and underexpression by transfection of ad5CMV-p16 to the A549 cells, and found that several proteins were up or down regulated by 2 fold or more. To characterize the proteins in more detail, we are identifying by PDQuest program and MALDI-TOF analysis. Taken together theseresults, we have to consider the potential effects of the other gene expressions except therapeutic gene n the host cells as asafety concerns

목차 Contents

• 표지 ...1
• 유전자치료제의 안전성평가를 위한 연구(II) ...3
• 서론...4
• 재료 및 방법...5
• 1. 시약 및 기기...5
• 2. 세포 배양...5
• 3. Ad5CMV-p16 및 ad5CMV (p16 null type) adenoviral vector 제조...5
• 4. Ad5CMV-p16 propagation 및 titer 결정...6
• 5. Ad5CMV-p16 및 ad5CMV 처리...6
• 6. 이차원 전기영동...6
• 7. DNA microarray...6
• 가. Macrogen cDNA microarray...6
• 나. Superarray cDNA microarray...6
• 다. Oligonucleotide microarray...7
• 결과 및 고찰...7
• 국문요약...8
• 참고문헌...9