초록 ▼

연구목적
- 본 연구에서는 새로운 뇌 특이 발현 유전자 RCl8의 전체 cDNA를 생쥐의 뇌 cDNA library로부터 클로닝하여 발현 조절 및 기능에 대한 기초연구를 수행하고자 하였다.
연구방법 및 결과
- RCl8 전체 CDNA는 2931 nucleotide로 구성되며, 548 아미노산으로 예측되는 open reading frame을 가지고 있었다.
- Rapid amplification of CDNA ends(RACE)법으로 mRNA 말단을 조사한 결과 5' 말단은 226 nucleotide의 5'-un

연구목적
- 본 연구에서는 새로운 뇌 특이 발현 유전자 RCl8의 전체 cDNA를 생쥐의 뇌 cDNA library로부터 클로닝하여 발현 조절 및 기능에 대한 기초연구를 수행하고자 하였다.
연구방법 및 결과
- RCl8 전체 CDNA는 2931 nucleotide로 구성되며, 548 아미노산으로 예측되는 open reading frame을 가지고 있었다.
- Rapid amplification of CDNA ends(RACE)법으로 mRNA 말단을 조사한 결과 5' 말단은 226 nucleotide의 5'-untranslated region(UTR)을 가진 단일종 말단이었으며, 3'-poly(A) 말단은 2.9 kb와 2.0 kb의 두 가지 transcript의 형태로 발견되었다. 두 transcript 모두 전체 open reading frame을 포함한다.
- Multiple tissue Northern blot 결과 RCl8은 뇌에서 선택적으로 발현되며, RT-PCR 결과 성체의 뇌의 모든 부위에서 다양한 양으로 발현되는 것으로 나타났다.
- RCl8 cDNA로부터 예측되는 단백질은 분자량과 등전점은 각각 62 kDa, 8.58이었다. RCl8 단백질은 leucine 함량이 높으며(12.23%), 4개의 leucine-rich repeats(LRR) domain과 1개의 LRR C-terminal flanking sequence(LRRCT)를 가지고 있었다. 이 단백질을 leubrin(leucine-rich repeat-containing brain enriched protein)이라고 명명하였다.
- Leubrin 단백질은 LGI1(Leucine-rich gene-Glioma Inactivated) 단백질과 53%, Slit 단백질과 30%의 서열 유사성이 있었다. 세 단백질의 서열에 있어서 LRR domain과 그 안의 cysteine들이 잘 보존되어 있었다.
- Leubrin은 N-말단 근처에 transmembrane domain으로 예측되는 서열이 발견되었으며, N-말단 signal sequence가 없는 type Ⅱ 막 단백질로 예측되었고, 2개의 asparagine-linked glycosylation site가 예측되었다.
- 대장균에서 발현, 분리정제된 leubrin에 대한 항체를 사용한 Western blot에서 생쥐의 뇌 조직에서는 75 kDa과 37 kDa, Neuro-2a 세포주에서는 45 kDa과 37 kDa의 단백질이 관찰되었다.
- 녹색형광 단백질과 fusion된 leubrin 단백질을 Neuro-2a 세포주에서 발현한 결과 leubrin 단백질은 세포질에서 세포핵 측면에 응집된 형태로 분포하였다.
- RCl8 transcript는 생쥐의 태아 발생시 성체로 발달되는 시간대별로 신경계에서 뇌 부위별로 특이적으로 현저한 mRNA 발현 증가가 관찰되었다. 생쥐의 Neuro-2a 세포주에 H-7을 처리하여 신경세포로의 분화시에는 mRNA 발현량이 현저히 감소하였다.
- Coimmunoprecipitation법을 사용한 leubrin과 결합하는 단백질을 뇌 조직에서 검색한 결과, leubrin과 특이적으로 결합하는 단백질들을 발견하였다.
기대효과
- 향후 이 신규 유전자 산물의 신경계 발생 및 분화에서의 역할 연구의 방향을 제시하였다.

Abstract ▼

Puropse
- In the process of searching for novel genes with selective brain expression, a novel mouse CDNA, named RCl8 was isolated, cloned and the regulation of its expression was investigated.
Methods and results
- Northern blot analysis shows that RCl8 mRNA is predominantly expressed in t

Puropse
- In the process of searching for novel genes with selective brain expression, a novel mouse CDNA, named RCl8 was isolated, cloned and the regulation of its expression was investigated.
Methods and results
- Northern blot analysis shows that RCl8 mRNA is predominantly expressed in the brain. Rapid amplification of cDNA ends(RACE) indicates that RCl8 mRNA has single S'-end and two alternative poly(A) termini.
- The RCl8 cBNA encodes a protein with 548 amino acids and a calculated molecular mass of 62 kDa. The predicted protein, which was named leubrin(Leucine-rich repeat-containing brain-enriched protein) contains four leucine-rich repeats(LRR) with C-terminal flanking sequences(LRRCT).
- Leubrin has ${\sim}53%$ homology with LGI1(Leucine-rich gene-Glioma Inactivated) and ${\sim}30%$ homology with slit protein.
- Leubrin has a predicted transmembrane domain near the N-terminus, but no N-terminal signal sequence, suggesting the type ll integral membrane topology,
- Two potential Asn-linked glycosylation sites are found in the middle domain of leubrin.
- Western blot with anti-leubrin antisera detected 75 kDa and 37 kDa proteins in mouse brain and 45 kDa and 37 kDa protein in Neuro-2a cells.
- Leubrin fused to enhanced green fluorescence protein expressed in Neuro-2a cells shows juxtanuclear localization.
- RT-PCR analysis show that RCl8 transcript is differentially upregulated in the widespread brain areas during mouse embryonic, fetal and postnatal development,
- RCl8 transcript is markedly downregulated during neuronal differentiation of neuroblastoma Neuro-2a cells treated with H-7.
- Coimmunoprecipitation experiments with leubrin antibody detected several candidate leubrin-associated brain proteins.
Perspectives
- Results from this study provided a new insight into the future research on the role of leubrin in brain develpment and neuronal differentiation.

목차 Contents

• I. 연구개발결과 요약문...4
• (한글)...4
• (영문)...5
• II. 연구개발과제 연구결과...6
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표...6
• 2. 연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...6
• 3. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...28
• 4. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...34
• 5. 연구개발과제의 활용계획...34