보건의료기술연구개발사업 최종보고서;급성 호흡곤란증후군 및 패혈증 환자에서 호중구 아포프토시스 기전의 규명 Mechanism of human neutrophil apoptosis in patients with acute respiratory distress syndrome or sepsis원문보기
호중구는 여러 염증성 질환에서 중심적인 역할을 하는 세포이며 호중구로부터 분비되는 여러 가지 염증 매개물질들로 인해 조직 파괴가 일어나게 된다. 호중구는 반감기가 매우 짧기 때문에 염증으로 인한 지속적인 조직 파괴를 피할 수 있지만 몇몇 염증성 질환에서는 호중구의 자발적인 아포프토시스가 억제되어 있어 지속적인 조직 파괴를 초래하게 된다. 본 연구의 목적은 급성 호흡곤란증후군 및 패혈증 환자를 포함하는 전신성 염증반응 증후군 (SIRS) 환자에서 호중구 아포프토시스 조절 이상의 분자생물학적 기전을 규명함으로서, 이를 이용한 새로운 치
호중구는 여러 염증성 질환에서 중심적인 역할을 하는 세포이며 호중구로부터 분비되는 여러 가지 염증 매개물질들로 인해 조직 파괴가 일어나게 된다. 호중구는 반감기가 매우 짧기 때문에 염증으로 인한 지속적인 조직 파괴를 피할 수 있지만 몇몇 염증성 질환에서는 호중구의 자발적인 아포프토시스가 억제되어 있어 지속적인 조직 파괴를 초래하게 된다. 본 연구의 목적은 급성 호흡곤란증후군 및 패혈증 환자를 포함하는 전신성 염증반응 증후군 (SIRS) 환자에서 호중구 아포프토시스 조절 이상의 분자생물학적 기전을 규명함으로서, 이를 이용한 새로운 치료 전략 개발의 기초를 제공하는데 있다. 전신성 염증반응 증후군에서 호중구의 아포프토시스가 지연되어 있는지를 확인하기 위해서 정상인과 전신성 염증반응 증후군 환자의 호중구를 분리하여 배양하면서 호중구의 아포프토시스를 형태학적 분석 및 Annexin-V를 이용한 FACS로 평가한 결과 전신성 염증반응 증후군 환자의 호중구에서 아포프토시스가 억제되어 있음을 확인하였다. 전신성 염증반응 증후군 환자에서 관찰되는 호중구 아포프토시스의 억제가 NF-kB 전사인자와 관련이 있는지를 평가하기 위하여, 정상인과 전신성 염증반응 증후군 환자의 호중구에서 NF-kB의 핵 내 이동 여부를 면역형광 염색을 시행하여 확인하였다. 정상인의 호중구에서는 NF-kB의 p65 subunit가 세포질 내에서 관찰되었는데, 전신성 염증반응 증후군 환자의 호중구에서는 대부분이 핵 내로 이동되어 있어 정상인에 비해 전신성 염증반응 증후군 환자의 호중구에서 NF-kB가 기저상태에서 활성화되어 있음이 시사되었다. 아포프토시스의 지연이 NF-kB의 활성화에 의한 새로운 단백의 합성에 의한 것인지를 평가하고자 호중구에 cycloheximide를 전처치하고 24시간동안 배양한 후 FACS로 아포프토시스의 변화를 관찰하였다. Cycloheximide의 전처치에 의해서 전신성 염증반응 증후군 환자로부터 분리한 호중구의 아포프토시스가 정상인의 호중구에서 보인 수준으로 증가하여 아포프토시스의 억제는 항 아포프토시스 작용을 보이는 새로운 단백의 합성에 의존하는 것으로 판단되었다. 항 아포프토시스 작용을 하는 단백이 NF-kB의 활성화에 의존하는 지를 평가하기 위하여 호중구에 proteasome 억제제인 MG132를 전처치하여 띠F-kB를 직접적으로 억제하고 24시간 동안 배양한 후 FACS 로 아포프토시스를 측정하였다. 전신성 염증반응 증후군 환자의 호중구에서 감소되어 있던 아포프토시스가 MG132 전처치로 정상인에서 보이던 수준으로 증가하였다. 이상의 결과는 전신성 염증반응 증후군 환자에서 관찰되는 호중구 아포프토시스의 지연은 NF-kB의 활성화와 밀접한 연관이 있다는 사실을 시사한다. 전신성 염증반응 증후군 환자에서 관찰되는 호중구 아포프토시스의 지연과 일반적으로 호중구 아포프토시스와 관련이 있는 것으로 알려져 있는 물질과의 관련성을 평가하기 위하여 정상인과 전신성 염증반응 증후군 환자의 말초혈액 호중구에서 열충격단백, 세포표면의 Fas 발현, caspase 3 발현 및 활성도, CDl6 발현 정도를 비교 평가하였다. 두 군에서의 차이가 관찰되지않아 열충격단백, Fas, caspase 3, CDl6 등은 전신성 염증반응 증후군 환자에서 관찰되는 호중구 아포프토시스의 지연과 직접적인 관련성이 없을 것으로 판단되었다. 세포 내에서 NF-kB 등의 전사인자의 활성을 조절하는 kinase 경로 중 PI3K 경로와 ERK, p38 MAPK 경로가 아포프토시스 억제와 연관이 있는가를 평가하였다. 각각의 경로에 대한 특이적 억제제를 전처치하고 24시간동안 배양한 후 FACS로 아포프토시스의 변화를 관찰하였는데, Pl3K의 특이적 억제제인 LY294002와 Wortmannin 전처치에 의해서 전신성 염증반응 증후군 환자의 호중구에서 아포프토시스가 유의하게 증가하였으며 특히 정상인에 비하여 환자에서 현저히 증가하여 Pl3K 경로가 환자에서 관찰되는 아포프토시스의 억제에 기여하고 있음을 확인하였다. ERK의 특이적 억제제 초래되지 않았다. 이상의 결과는 전신성 염증반응 증후군 환자에서 관찰되는 호중구의 아포프토시스 억제에는 NF-kB가 중요한 역할을 하며 Pl3K 경로의 활성화가 기여하는 것으로 생각된다.
Abstract▼
Neutrophils are the main inflammatory cells in various inflammatory diseases. Although the inflammatory mediators secreted from neutrophils are responsible for the tissue destruction, it is limited by the short half life of neutrophils. However, in severe inflammatory disease including SIRS, the per
Neutrophils are the main inflammatory cells in various inflammatory diseases. Although the inflammatory mediators secreted from neutrophils are responsible for the tissue destruction, it is limited by the short half life of neutrophils. However, in severe inflammatory disease including SIRS, the persistent tissue destruction may be caused by the prolonged survival of neutrophils. The purpose of this study is to investigate the mechanism of prolonged survival of neutrophils in patients with systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Neutrophils from healthy persons and patients with SIRS were purified and incubated, then the apoptotic neutrophils were quantitated by FACS using Annexin-V or Wright-Giemsa staining. The percentage of the apoptotic neutrophils from patients with SIRS was lower than those from healthy persons at each time points. To evaluate if the de novo protein synthesis is required for the decreased spontaneous apoptosis, neutrophils were incubated in the presence or absence of cycloheximide for 24 hours. The percentage of apoptotic neutrophils in patients with SIRS was increased to the level of heathy persons by cycloheximide treatment, suggesting the presence of certain anti-apoptotic protein(5). To test whether the production of anti-apoptotic protein is dependent on the activation of NF-kB, neutrophils were incubated with or without proteasome inhibitor, MG132, for 24 hours. The decreased spontaneous neutrophil apoptosis in patients with SIRS was overcome by MG132 treatment. The NF-kB subunit p65 was located in the nucleus in freshly isolated neutrophils from patients with SIRS compared to the cytoplasmic location in healthy persons. These observations suggest that the prolonged survival of neutrophils in patients with SIRS is due to the decreased spontaneous apoptosis, and it is closely linked to the activation of NF-kB. We, next evaluated the relationship between the delayed apoptosis and the HSP expression, Fas expression on the cell surface, caspase 3 activity, and CDl6 expression. The differences in these variables between neutrophils from normal healthy persons and from patients with SIRS were not observed, suggesting that these variables are less likely to be involved in the delayed neutrophil apoptosis. The role of PI3K, ERK, and p38 MAPK in the delayed neutrophil apoptosis were evaluated. These molecules regulate cellular survival and death via transcription factors including NF-kB. Neutrophils were incubated in the presence or absence of the specific inhibitors of each pathways for 24 hours then the apoptotic neutrophils were quantitated by FACS using Annexin-V. The percentage of apoptotic neutrophils in patients with SIRS was markedly increased by pretreatment with specific inhibitors of PI3K, that is, wortmannin and LY294002, suggesting the role of PI3K in the delayed apoptosis of neutrophils from SIRS patients. However, pretreatment with specific inhibitors of ERK (PD98059) or p38 MAPK (SB203580) did not result in the changes of apoptosis. We conclude that NF-kB activation and PI3K activation contributes to the delayed apoptosis of neutrophils from SIRS patients.
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