초록 ▼

방선균에서 균체분화와 항생물질의 생합성을 조절하는 인자를 규명하고 해당 인자를 생합성하는 유전자의 구조와 그 발현 양상을 동시에 연구하여 항생물질 생합성과 균체 분화와의 관계성을 규명하는 기초연구를 수행하여 장차 산업적으로 항생물질 생산의 생산 수율을 증진하는 원리를 개발하여 실제 활용코자 하였다.S. clavuligerus에서 (p)ppGpp 생합성 유전자를 해독하고 동 유전자를 절제한 변이주 ΔrelA 및 ΔspoT를 취득하여 비교한 결과, 항생물질 생합성과 세포분화가 완전히 소실된 것으로 확인되었다. 따라서 (p)ppGpp는

방선균에서 균체분화와 항생물질의 생합성을 조절하는 인자를 규명하고 해당 인자를 생합성하는 유전자의 구조와 그 발현 양상을 동시에 연구하여 항생물질 생합성과 균체 분화와의 관계성을 규명하는 기초연구를 수행하여 장차 산업적으로 항생물질 생산의 생산 수율을 증진하는 원리를 개발하여 실제 활용코자 하였다.S. clavuligerus에서 (p)ppGpp 생합성 유전자를 해독하고 동 유전자를 절제한 변이주 ΔrelA 및 ΔspoT를 취득하여 비교한 결과, 항생물질 생합성과 세포분화가 완전히 소실된 것으로 확인되었다. 따라서 (p)ppGpp는 항생물질 및 세포분화에서 중요한 조절 인자로 판단되었다. 현재 (p)ppGpp가 항생물질 생합성 과정에 직접 관련된 목적 물질을 규명하는 연구를 진행하고 있다. 또한 β-lactam 항생물질분해효소를 저해하는 BLIPS를 생성하는 유전자를 규명하고 동 물질을 생성하는 유전자를 절제한 변이주 (null mutants) 제조하고 BLIPS가 세포내에서 상호작용하는 물질을 규명하고자 yeast two-hybrid system 및 proteomics 방법으로 해당 단백질을 규명하는 연구를 진행하고 있다. 한편 세포분화에 깊게 관련된 것으로 확인된 저분자 protease 저해물질을 분해하는 효소가 세포분화에 미치는 영향을 규명하고자 하였다 이를 위해 John Innes Centre에서 개발한 PCR-Targrting 방법을 이용하여 유전자를 효율적으로 파괴하여 변이주의 특성을 분석중이다.본 연구실에서는 항생물질 및 세포 분화에 관련된 물질을 분리 동정 및 그 특성을 규명하고 해당 유전자를 분석하는 일에 우선 집중하였다 한편 영국의 John Innes Biotechnology Center에서 유전자를 완벽하게 해독한 Streptomyces coelicoior를 기본으로 하여 해당 유전자의 기능과 발현 기작을 규명하고자 하였다. 현재까지 얻은 연구 결과에 몇 가지를 더 보완하면 세계적으로 우수한 학술지에 계재될 가능성이 매우 높다고 판단된다. 이미 수 차례 국내외 학술발표 대회에서 발표한바 있고 많은 관심을 가지고 본 연구 결과를 주시하고 있는 바 본 연구의 결과는 기초는 물론 응용 면에서도 크게 활용될 것으로 판단된다.

Abstract ▼

For many years, the two laboratories (Keith Chafer in 1 K and Kye Joon Lee in Korea) have been working in parallel to study the regulation of secondary metabolism and morphological differentiation in streptomycetes (the bacteria mainly involved in industrial production of antibiotics).
The K. Cha

For many years, the two laboratories (Keith Chafer in 1 K and Kye Joon Lee in Korea) have been working in parallel to study the regulation of secondary metabolism and morphological differentiation in streptomycetes (the bacteria mainly involved in industrial production of antibiotics).
The K. Chafer laboratory has focussed on a genetic approach using the model organism, S. coelicolor A3(2), and the seoul laboratory has exploited the more favourable physiological properties of other streptomycetes that do not have well developed genetics. In this proposal, we aim to bring our complementary approaches together to achieve greater penetrance of questions of mutual (and general) interest. The proposed studies will focus on the regulation and roles of extracellular proteins that are associated with, or causally connected to, sporulation.
These have been studied in K J Lee laboratory two organisms: S. clavuligerus and S. exfoliatus , which has the special feature of undergoing submerged sporulation, and in which extracellular proteases are associated with sporulation; and S. exfoliatus, in which two ,extracellular BLIPS ( β -lactamase inhibition proteins) have been discovered, one of which is essential for aerial growth and sporulation on solid medium.
The aim of our study is to relate these exrtracellular phenomena to a more global analysis of the intracellular genetic regulation of morphological differentiation that has been carried out at Norwich using S. coelicolor A3(2). From this we hope to gauge the extent to which the phenomena being studied are species-specific or of general relevance to the whole Streptomyces genus. The experiments proposed will include the ;Following. The objectives of the current
(1) Insertion of the S. clavuligerus and S. exfoliatus genes at single copy into a large collection of S. coelicolor developmental mutants to evaluate the dependence of the transgenes on the S. coelicolor developmental regulatory genes. The production of the extracellular proteins will be monitored immunologically. The mutants to be tested may include those with sporulation-specific blocks (ωhi mutants), and those with blocks that affect both morphological development and secondary metabolism (bid and relA mutants).
(2) The analysis of S. coelicolor genes, related to the S. clavuligerus and S.exfoliatus genes that are expected to emerge from the ongoing S. coelicolor genome sequencing project. These genes will be analysed by disruption and by transcription studies at Norwich, and biochemical analysis of extracellular protein production using the fermentor facility in Seoul.
The planned collaboration would involve two visits from Korea to UK for the performance of genetic experiments involving S. coelicolor, of a total duration of 6 months, and one visit of Professor Chafer to Seoul for the purpose of on-site evaluation and planning of work in K. J. Lee laboratory involving S. coelicolor.

목차 Contents

• 제 1 장 연구 개발 과제의 개요...11
• 제 2 장 국내 외 기술 개발 현황...12
• 제 1 절 β-lactam 항생물질 생합성 유발인자에 관한 연구...12
• 1. Stringent response의 개요...12
• 2. relA/spoT homologues의 분류...12
• 3. Escherichia coli RelA 단백질의 기능 연구...13
• 4. 방선균에서의 relA/spoT homologues에 대한 연구...13
• 5. Streptomyces clavuligerus에서 항생물질 생합성 조절인자 연구...14
• 6. 본 연구의 목적...15
• 제 2 절 β-lactam 항생물질 불활성효소 억제인자 연구...16
• 1. S. exfoliatus SMF19의 β-lactamase inhibitory protein 연구...16
• 2. BLIP 연구 동향...16
• 3. 단백질 상호작용 분석 기술...17
• 4. 본 연구의 목적...17
• 제 3 절 PCR방법을 이용한 Streptomyces spp.기 세포분화관련유전자의 disruption...19
• 1. S. exfoliatus SMF13의 세포분화 조적인자에 관한 연구...19
• 2. PCR Targetingdmd 이용한 유전지 파괴법...20
• 3. 본 연구의 목적...21
• 제 3 장 연구범위 및 연구수행 방법...22
• 제 1 절 β-lactam 항생물질 생합성 유발인자에 관한 연구...22
• 1. 연구내용...22
• 2. 재료 및 방법...22
• 3. 결과 및 고찰...30
• 제 2 절 β-lactam 항생물질 불활성효소 억제인자 연구...49
• 1. 연구내용...49
• 2. 재료 및 방법...49
• 3. 결과 및 고찰...67
• 제 3 절 PCR방법을 이용한 Streptomyces spp.의 세포분화관련유전자의 disruption...102
• 1. 연구내용...102
• 2. 재료 및 방법...102
• 3. 결과 및 고찰...103
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...109
• 제 1 절 연구 목표 달성도...109
• 제 2 절 기술발전에의 기여도...109
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...110
• 제 1 절 추가 연구의 필요성...110
• 제 2 절 타 연구에의 응용...110
• 제 3 절 기업화 추진 방안...111
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...112
• 제 1 절 β-lactam 항생물질 생합성 유발인자에 관한 연구...112
• 제 2 절 β-lactam 항생물질 불활성효소 억제인자 연구...113
• 제 3 절 방선균 세포분화 조절 인자의 생합성에 관한 연구...114
• 제7장 참고문헌...115
• 첨부문서...131