보고서 정보
주관연구기관 |
신진메딕스(주) Shin Jin Medics Inc |
연구책임자 |
이관행
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2003-05 |
과제시작연도 |
2002 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO200400000150 |
과제고유번호 |
1460001088 |
사업명 |
휴먼의료공학기술개발 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
열성질환.febrile disease.
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초록
▼
목적 : 렙토스피라증, 쯔쯔가무시증, 신증후군 출혈열(3종 열성질환)은 원인 병원체가 각기 다르나 임상증상과 주요 발병 계절이 유사하여, 조기 치료를 위한 감별 진단이 요구된다. 본 연구에서는 일선 의료 기관에서 신속, 간편하게 이용할 수 있도록 민감도와 특이도가 높은 재조합 항원을 개량하여 진단시약을 제조하고자한다.
방법 : rFlaB(렙토스피라 편모항원)와 r56 kDa(쯔쯔가무시 표면 단백항원) 단백의 발현 조건 중 IPTG 농도 (0.1∼1 mM), 유도시간 (2hr∼overnight), 온도(20℃∼37℃) 변화와 정
목적 : 렙토스피라증, 쯔쯔가무시증, 신증후군 출혈열(3종 열성질환)은 원인 병원체가 각기 다르나 임상증상과 주요 발병 계절이 유사하여, 조기 치료를 위한 감별 진단이 요구된다. 본 연구에서는 일선 의료 기관에서 신속, 간편하게 이용할 수 있도록 민감도와 특이도가 높은 재조합 항원을 개량하여 진단시약을 제조하고자한다.
방법 : rFlaB(렙토스피라 편모항원)와 r56 kDa(쯔쯔가무시 표면 단백항원) 단백의 발현 조건 중 IPTG 농도 (0.1∼1 mM), 유도시간 (2hr∼overnight), 온도(20℃∼37℃) 변화와 정제 과정 중 imidazole 농도, pH 조건의 변화에 따른 수율을 비교하여 최적 조건을 확립하였다. 정제된 재조합 항원의 진단용으로 유효성을 Western blot과 ELISA을 이용하여 다른 유사 발열성질환에 대한 교차반응 및 각 표준 진단법과 민감도와 특이도를 비교하였다. 한편 시판되고 있는 진단 키트와도 비교하였다.
결과 : rFlaB는 렙토스피라의 면역 유발 항원으로 Flagella protein으로, 이 항원은 Nasreen I. Bughio 등에 의하여 fluorescence polarozation assay(FPA)를 이용 MAT양성 혈청에 대하여 83.7 %가 양성으로 MAT 음성 혈청에 대하여 81.2%가 음성으로 확인되어 렙토스피라증의 진단을 위하여 효용성이 입증되었으며, 본 연구에서도 rFlaB 항원의 IgG, IgM-ELISA 결과 민감도 88.3 %, 72 % 특이도 87.9 %, 90 %를 보여 진단용 항원으로서의 가치를 재확인 하였으며, 또한 생산된 시제품 ELISA 키트를 사용한 결과에서 IgG와 IgM에서 민감도 93.3% (MAT항체가 1:80-1:320), 90.0 %(MAT 항체가 ≥1:640)과 60.0% (MAT항체가 1:80-1:320), 100 %(MAT 항체가 ≥1:640)이었으며, 특이도 91.4 %, 80.1 %로, IgG의 민감도와 특이도는 90 %이상으로 높았고 IgM의 경우도 항체가 1:640이상에서는 100%의 민감도와 80.1%의 특이도를 나타내었으며, 3종 동시진단 Rapid 키트에서는 민감도 항체가 1:640 이상에서는 95.0 %로 높았으나 1:80-1:320에서는 40.0 %이었고, 특이도 99.3 %로 매우높았다. 이와 같은 결과에서 1:80에서 1:32까지의 낮은 항체가에 대한 민감도 개선의 필요성이 있으나 진단 키트로서의 유효성은 입증되었다.
56kDa는 쯔쯔가무시증의 원인 병원체인 Orientia tsutsugamushi의 외막 단백으로 주요표면 항원으로 많은 연구가 되어왔다. MeraganV. Land는 쯔쯔가무시 Karp주와 Gilliam주 whole cell을 이용한 ELISA와 56kKa 재조합 단백을 이용한 ELISA를 비교하여 유사한 결과를 보고 하였고, whole cell을 이용한 indirect immunoperoxidase(IIP)를 표준으로 하여 r56을 이용한 ELISA 결과 민감도 86-88 %를 특이도 84-90 % 임을 보고 하였다. 본 연구의 결과 재조합 항원 56kDa 항원성은 IgG와 IgM ELISA에서 민감도 83.8 %, 83 %, 특이도 96.6 %, 97 %의 결과를 나타내었으며, 시제품으로 제작된 ELISA 진단 키트에서는 낮은 양성 항체가인 1:128과 1:256에서는 IgG와 IgM의 민감도가 62.5 %와 75 %로 낮았으나, 1:512이상에서는 97.2% 93.0%로 민감도가 우수하였으며 특이도도 85.7 %와 94.5%로 높은 결과를 보여 주었다. 3종 동시진단 Rapid 키트의 경우 항체가 1:128과 1:256에서는 18.8%외 낮은 민감도를 나타내었으나 1:512이상에서는 97.2%의 민감도와 98.9%의 특이도를 보여 낮은 항체가에 대한 개선이 필요하나 진단용 항원으로 유효함을 확인하였다.
신증후군출혈열 진단을 위한 항원으로 재조합 N-protein를 이용하였으며, 항원성은 ELISA에 의한 IgG와 IgM 각각의 민감도와 특이도는 100%, 76.5%와 90.5%, 90.7%로 IgG의 민감도가 매우 우수하고, 특이도도 높아 진단용으로 활용할 가능성을 보여주었다. ELISA와 3종 동시진단 Rapid 키트의 경우 민감도가 96.2%와 84.6%이었으며 특이도는 IgG 79.4%, IgM 83.5 % 그리고 91.7%로 다른 항원에 비해 다소 낮으나 감별 진단용을 위해서는 유용함을 알 수 있었다.
이와 같은 결과를 종합 분석하여 보면 본 연구에서 개발한 각 병원체의 주요 항원 부위에 대한 재조합 단백 항원을 이용한 ELISA 진단 키트와 3종 동시 Rapid 키트는 기존의 상용되고 있는 진단 키트보다 우수함을 알 수 있었으며 일선 병의원에서 간편하게 3가지 발열성질환에 대하여 혈청학적 실험실 감별진단에 유용함이 확인되었으며, 각 항원을 이용한 ELISA 키트와 3종 동시진단 Rapid 키트를 상품화 할 경우 ELISA는 대량 진단을 가능하며, immunochromatography assay (Rapid) 키트는 특별한 장비가 필요하치 않고 판정에 객관성이 높아 일선 의료기관에서 효율적으로 이용될 수 있으며 고가의 수입 키트에 대체 될 수 있어 경제적 효과도 기대된다.
특히 3종 동시 진단키트는 본 연구에서 최초로 개발되었으며 이는 발생시기와 임상증상이 유사하여 감별진단의 필요성에 부응하는 진단 키트로서 가치가 높아, 앞으로 낮은 양성항체가에 대한 민감도 개선을 위한 연구를 보충하여 상품화 시키고저 한다.
Abstract
▼
Purpose; Leptospirosis, tsutsugamushi disease, hemorrhagi fever with renal syndrome(three hinds of febrile disease) are caused by different agents, but show close clinical symptoms and same season of prevalence. Therefore, differential diagnosis is needed for early treatment. In this study, we tried
Purpose; Leptospirosis, tsutsugamushi disease, hemorrhagi fever with renal syndrome(three hinds of febrile disease) are caused by different agents, but show close clinical symptoms and same season of prevalence. Therefore, differential diagnosis is needed for early treatment. In this study, we tried to improve sensitive and specific recombinant antigen for a diagnostic kit which can be used quickly and easily in the regional hospitals.
Method : To establish the optimum condition, we compared the yields fer different IPTG concentrations (0.1 ∼ 1 mM), induction times (2 hr ∼ overnight) and temperatures (20 ∼37℃), which are related to the revelation of rFlaB (flagella antigen for Leptospira) and r56 kDa (surface protein antigen of tsutsugamushi). We also compared tile yields for different imidazole concentrations and pH values during the purification process. The effectiveness of the purified recombinant proteins as a diagnostic antigen kit was evaluated by Western immunoblotting and ELISA. The degree of cross-reaction with other febrile diseases was examined and tile sensitivity and specificity were compared with the standard method. Those diagnostic kits were also compared with tile commercial diagnostic ones.
Results : Results of rFlaB IgG, IgM ELISA were as follows ; sensitivity were 88.3%, 72%, specificity were 87.9%, 90%. Results of ELISA evaluation kits were as follows : sensitivities of IgG and IgM were 93.3 (MAT titer 1:80-1:320), 90.0% (MAT titer >1:640) and 60% (MAT titer 1:80-1:320), 100% (MAT titer >1:640) and specificities were 91.4% and 80.1%. Results of Muti-Rapid kits were as follow ; sensitivities were 95.0% (MAT titer > 1:640) and 40.0% (MAT titer 1:80-1:320) and specificity was 99.3%.
Results of r56kDa IgG, IgM ELISA were as follows : sensitivity were 83.8%, 83%, specificity were 96.6%, 97%. Results of ELISA evaluation kits were as follows : sensitivities of IgG and IgM were 62.5% and 75% (MAT titer 1:128-1:256), 97.2% and 93.0% (MAT titer >1:512) and specificities were 85.7% and 94.5%. Results of Muti-Rapid kits were as follow ; sensitivities were 18.8% (MAT titer 1:128-1:256) and 97.2% (MAT titer >1:512) and specificity was 98.9%.
Results of recombinant N-protein IgG, IgM ELISA were as follows ; sensitivity were 100%, 76.5%, specificity were 90.5%, 90.7%. Results of ELISA evaluation kits and were as follows ; sensitivity was 96.2% and specificities of IgG and IgM were 79.4% and 83.5%. Results of Muti-Rapid kits were as follow : sensitivity was 84.6% and specificity was 91.7%.
Multi-Rapid kit, developed firstly at this project, will be useful in differential diagnosis of three similar fever disease with similar prevalent season and symptoms. After sensitivity upgrade of low titer, Multi-Rapid kit might be useful in field test.
목차 Contents
- 표지 ...1
- 제출문 ...2
- 목차 ...3
- I. 연구개발결과 요약문 ...4
- 요약문 ...4
- Project Summary ...6
- II. 총괄연구개발과제 연구결과...7
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...7
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...7
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...17
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...19
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...21
- 6. 첨부서류...22
- III. 제1세부연구개발과제 연구결과 (세부과제별로 작성)...23
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...24
- 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...25
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...32
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...34
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...36
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획...37
- 7. 참고문헌...37
- IV. 제2세부연구개발과제 연구결과 (세부과제별로 작성)...40
- 1 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...41
- 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...41
- 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...43
- 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...52
- 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...53
- 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획...54
- 7. 참고문헌...54
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