초록 ▼

1)연구목적
Telomerase를 구성하는 효소단백질 hTERT조절에 의해 telomerase활성도가 결정되며 정자세포와 기간세포를 제외한 정상 체세포에서는 발현되지 않는 telomerase가 발암과정에서 hTERT전사증가와 함께 활성화됨에 근거하여 유망한 암치료법으로서 hTERT promoter조절에 의한 telomerase활성화 억제방법을 개발하고자 본 연구는 다음 목적을 설정하였음.
(1) 인체세포의 hTERT promoter클로닝
(2) hTERT promoter에 작용하는 암세포 특이 전사인자의 screen

1)연구목적
Telomerase를 구성하는 효소단백질 hTERT조절에 의해 telomerase활성도가 결정되며 정자세포와 기간세포를 제외한 정상 체세포에서는 발현되지 않는 telomerase가 발암과정에서 hTERT전사증가와 함께 활성화됨에 근거하여 유망한 암치료법으로서 hTERT promoter조절에 의한 telomerase활성화 억제방법을 개발하고자 본 연구는 다음 목적을 설정하였음.
(1) 인체세포의 hTERT promoter클로닝
(2) hTERT promoter에 작용하는 암세포 특이 전사인자의 screening
(3) hTERT 전사조절 인자의 작용부위 및 작용특성 규명
(4) hTERT 전사인자의 활용방법 모색
2)연구방법
상기목적물 위하여 연구목적에 따라 다음 방법을 시도하였음.
(1) 인체세포의 hTERT promoter클로닝
①hTERT promoter클로닝을 위하여 hTERT cDNA의 transcription initiation site를 결정짓는 5′RACE(Rapid Amplification of cDNA End)를 시행하였음.
②hTERT 5′RACE결과에 근거하여 hTERT promoter부위를 클로닝하기 위한 reverse primers를 제작하였고 이들 primers와 human genome DNA 및 Clontech사의 GenomeWalk시약에 의한 hTERT promoter의 genomic PCR을 시행하였음.
③클로닝된 hTERT promoter를 TOPO vector(Invitrogen사)에 삽입하고 Sequencing방법에 의해 염기서열을 판독하였고 hTERT promoter부위를 Luciferase assay를 위해 pGL3basic vector로 옮겼음.
(2) hTERT promoter에 작용하는 암세포 특이 전사인자의 screening
①암세포 특이 전사인자를 찾기 위해 정상 위점막조직의 RNA와 위암조직의 RNA를 미용한 cDNA subtraction방법과 cDNA microarray방법을 사용하였고 정상조직에 비해 암조직에서 발현도가 현저히 차이나는 전사인자 및 암유전자들을 선별한 뒤 RT PCR방법으로 실제로 정상 조직에 비해 암조직에서 발현도가 차이나는지를 확인하였음, 이와 같이 선별된 암특이 전사인자 및 암유전자들을 hTERT promoter에 작용하는 지의 여부를 Firefly luciferase assay방법으로 분석하기 위해 각 유전자들을 Genebank에서 cDNA의 염기서열을 확인한 후 coding sequence를 클로닝하기 위한 primers를 제작하였고 이들 primers와 human fetal cDNA library(Clontech사)를 사용하며 각 유전자를 PCR클로닝하였음. 클로닝된 각 유전자는 mammalian expression vector인 pClneo에 삽입하여 transfection study에 사용하였음.
②hTERT promoter 및 그 deletion constructs를 각기 여러 가지 암유전자와 전사인자들과 함께 인체 세포주에 cotransfection시킨 결과를 Firefly luciferase assay방법으로 분석하였음.
(3) hTERT 전사조절 민자의 작용부위 및 작용특성 규명
조사하는 전사인자가 작용하는 hTERT promoter부위를 파악하기 위해 hTERT promoter염기서열상의 제한효소 위치를 확인한 뒤 이들 제한효소를 이용하여 여러 크기의 deletion promoter constructs를 생성하였음. 이들 deletion promoter constructs는 pGL3basic메 삽입되어 각종 전사인자에 의한 Firefly luciferase assay방법에 따라 전사인자에 대한 반응을 분석하였음.
(4) hTERT 전사인자의 활용방법 모색
hTERT전사를 조절하는 주요 인자가 발견될 경우 이들 인자의 작용을 강화 또는 억제시키는 방법(dominant negative constructs, overexpression)에 의해 실제로 이?결과
(1) 인체세포의 hTERT promoter클로닝
1.7kb크기의 hTERT promoter가 클로닝되었고 이로부터 1.3kb, 1kb, 0.9kb, 0.7kb, 0.3kb, 0.1kb, 58bp 등의 크기를 갖는 다양한 deletion promoter constructs가 생성되었음.
(2) hTERT promoter에 작용하는 암세포 특이 전사인자의 screening위암조직 및 정상 위점막조직의 RNA를 이용한 cDNA microarray결과 발현도가 뚜렷이 틀린 인자들은 총 317종으로서 96종은 발현도가 위암조직에서 증가하였으며, 221종은 발현도가 위암조직에서 감소한 것으로 나타났음. 이들 인자 중 전사인자를 선별하면 90종의 발현증가 인자 중 5종과 221종의 발현감소 민자 줌 10종에 불과하였음. 따라서 Hippo등(Cancer Res 62, 233-240, 2002)이 oligonucleotide microarray방법에 의해 분석된 위암에서 발현되는 유전자 자료를 참고하여 정상조직에 비해 발현도가 10배 이상 증가되는 것으로 보고된 Ets2, ATDC, E1AF등의 인자를 분석대상에 포함시켰음. 따라서 hTERT promoter에 대한 전사작용을 조사하기 위해 fetal cDNA library 및 암세포주의 cDNA library로부터 PCR방법으로 클로닝한 인자들은 c-Abl, ATDC, AP2, CREG, ELF3, ESE2, ESE3, ETS2, E1A, E2F4, HDAC, MSX, c-Myc, PDEF, K-Ras, RBBP4, Src, SP1, TIFF1, TIFF2등이며 이들 각각의 인자들은 대부분이 pClneo 벡터에 subcloning되어 hTERT promoter와 cotransfection방법에 의해 hTERT전사에 대한 영향을 분석하였음. 그 결과 사용한 인체 세포주의 종류에 따라 동일한 인자라도 hTERT전사에 대한 영향이 다소 틀리게 나타났으나 E1A의 경우 세포주에 상관없이 hTERT전사를 촉진하는 것으로 나타났음(E1A는 adenoviral gene임).
3) hTERT 전사조절 인자의 작용부위 및 작용특성 규명hTERT promoter부위의 염기서열을 (-)1659번부터 (＋)34번까지의 부위 기준으로 분석한 결과 (-)247번 및 (-)941번 염기 부근에서 Src, ELF3(ERT), E1A등의 작용이 다른 부위에 대한 작용에 비해 컸음. HX의 경우 HepG2세포주에서 hTERT전사를 촉진하였고 K-ras의 경우 hTERT전사를 억제하였음. E7, JNK등은 MCF7 세포주에서 hTERT전사를 촉진하였고 p53에 의해 hTERT전사가 억제되었으나 E1A에 의해 p53의 억제효과가 상쇄되었음. SaOS2세포주에서 p53, K-ras의 hTERT억제효과가 확인되었음. 특히 SaOS2세포주에서 ELF3, E2F4등과 E1A의 hTERT전사 synergy효과가 뚜렷하였음. AGS세포주에서 hTERT전사에 대해 ESE3와 c-Myc의 synergy효과 및 E2F4와 E1A의 synergy효과가 뚜렷하였음.
(4) hTERT 전사인자의 활용방법 모색-hTERT전사를 확실히 조절할 수 있는 인자를 발견하는 대로 dominant negative construct와 overexpression방법을 시도할 예정임.

Abstract ▼

Backgrounds-Telomere length is maintained b the telomerase which is a ribonucleoprotein polymerase. In normal human cells, telomere length is not maintained and telomerase is not active except sperm and stem cells. However, in tumors, telomerase becomes active. Telomere length is a molecular clock d

Backgrounds-Telomere length is maintained b the telomerase which is a ribonucleoprotein polymerase. In normal human cells, telomere length is not maintained and telomerase is not active except sperm and stem cells. However, in tumors, telomerase becomes active. Telomere length is a molecular clock determining cellular fate toward apoptosis, senescence or immortalization. So telomerase, as a key factor for telomere length has been studied to figure out its control mechanism. Human telomerase catalytic subunit(hTERT), as a component of telomerase was identified as a determining factor of telomerase activity. This study was aimed at identification of main factor(s) which regulated hTERT transcription in cancer cell and was also aimed at characterization of the specific factor responsive elements in the hTERT promoter region.
Methods
1) Cloning of hTERT promoter
To clone hTERT promoter, 5′ end of hTERT cDNA was determined by 5′RACE and hTERT promoter was cloned by genomic PCR using GenomeWalk reagent(Clontech). The cloned hTERT promoter was inserted into TOPO vector and sequenced. hTERT promoter was subcloned into pGL3basic for Firefly luciferase assay.
2) Screening for cancer specific transacitivator(s) of hTERT
Transient transfection and Firefly luciferase assay were done with hTERT promoter and transcription factors selected by cDNA microarray data from cancerous region and normal mucosa of stomach. Each transcription factor was cloned from fetal cDNA library and screened for hTERT promoter.
3) Characterization and mapping of cis acting elements in hTERT promoter region
Several deletion constructs for hTERT promoter were generated and compared for their response to several factors by Firefly luciferase assay. Especially, most factors were subcloned into the same mammalian expression vector, pClned to minimize vias according to using different kinds of vectors.
Results
1) 1.7 Kb sized hTERT promoter region was cloned by specific reverse primers, human genome DNA and GenomeWalk reagent(Clontech). Several deletion constructs for hTERT promoter were generated as 1.3kb, 1kb, 0.9kb, 0.7kb, 0.3kb, 0.1kb, AND 58bp sized hTERT promoter regions.
2) A total of 317 kinds of factors were identified to be changed in their expression level by cDNA microarray data from cancerous region and normal mucosa of stomach. Five factors were transcription factors among the 96 kinds of increased factors from stomach cancer. Also, Ten factors were transcription factors among the 221 kinds of decreased factors from stomach cancer. So, Other reports were reviewed concerning specific factors from cancer tissue and Ets 2, ATDC, E1AF were found to be increased around 10 folds in comparison with normal tissue(Hippo et al, Cancer Res 62, 233-240, 2002), Ets2, ATDC, E1AF were additionally decided to analyze their transcriptional activity.
Several transcription factors including c-Abl, ATDC, AP2, CREG, ELF3, ESE2, ESE3, ETS2, E1A, E2F4, HDAC, MSX, c-Myc, PDEF, K-Ras, RBBP4, Src, SP1, TIFF1, TIFF2 were cloned. Those factors were proved to have variable transcriptional activity for hTERT according to cellular context. However, especially, E1A, the adenoviral gene, was proved to enhance hTERT transcription regardless of cellular context.
3) hTERT promoter was numbered from (-)1659 to (＋)34 and several regions of hTERT promoter were compared in their transcriptional response to each specific factor. Src, ELF3(ERT), E1A enhanced hTERT transcription specifically around (-)247 and (-)941 in HepG2 cells. HX showed marked enhancement of hTERT transcription in HepG2 cells but K-ras suppressed its transcription. E7, JNK enhanced hTERT transcription but p53 suppressed its transcription which was compensated by E1A. p53, K-ras suppressed hTERT transcription in SaOS2 cells. Especially, ELF3, E2F4 and E1A showed marked synergetic effect for hTERT transactivation in SaOS2 cells. ESE3 and c-Myc showed synergetic effect for hTERT transactivation in AGS cells which was the same finding with E2F4 and E1A in AGS cells.
Conclusion-hTERT transcription must be activated during carcinogenesis and several transcription factors seemed to be involved in its activation. Those factors can be specific to cancer cells. However, any single factor cannot be the determinant for hTERT activation even though it can bind to hTERT promoter region. The interaction between several factors might be the determinant for hTERT activation of cancer cells.

목차 Contents

• Ⅱ. 단독연구개발과제 연구결과...8
• 1. 최종 연구개발 목표...8
• 2. 최종 연구개발 내용 및 결과...10
• 3. 연구결과 고찰 및 결론...66
• 4. 연구성과 및 목표달성도...68
• 5. 활용계획...69
• 6. 참고문헌...70
• 7. 첨부서류...74