초록 ▼

${\diamondsuit}$ 연구목적 및 결과
세파계 항생제의 생산에 있어서 주요한 기초원료인 7-ACA는 Cephalosporin C(CPC)의 화학적 탈아실화 공정에 의해 얻어진다. CPC로부터 7-ACA의 생산은 독성화합물을 사용한 비싸고 유독한 화학공정에 의해 수행된다. 그러나 cephalosporin acylase (CA)효소에 의해 7-ACA를 생산하는 효소공정이 실용화되지 않고 있다. 가장 큰 이유는 CA가 기질인 Glutaryl-7-ACA (CL-7-ACA)에 대해서 반응성이 매우 큰데 반하

${\diamondsuit}$ 연구목적 및 결과
세파계 항생제의 생산에 있어서 주요한 기초원료인 7-ACA는 Cephalosporin C(CPC)의 화학적 탈아실화 공정에 의해 얻어진다. CPC로부터 7-ACA의 생산은 독성화합물을 사용한 비싸고 유독한 화학공정에 의해 수행된다. 그러나 cephalosporin acylase (CA)효소에 의해 7-ACA를 생산하는 효소공정이 실용화되지 않고 있다. 가장 큰 이유는 CA가 기질인 Glutaryl-7-ACA (CL-7-ACA)에 대해서 반응성이 매우 큰데 반하여 CPC에 대해서는 너무 낮은 기질친화력을 가지고 있어서 공업적 생산에 적용할 수 없다. 기질인 glutaryl-7-ACA가 결합된 CA complex의 X-선 결정구조 분석을 통하여 결합에 관계하는 CA 활성부위 아미노산 잔기를 분석하는 구조생물학적 연구를 수행하였다. 그리고 이러한 활성부위 잔기에 대한 구조정보를 이용하여 CPC에 대한 반응성을 향상시킬수 있는 CA를 고안하기 위하여 기질의 결합에 관여하는 아미노산에 대한 돌연변이를 수행하여 CPC에 대한 활성이 증가된 CA를 개발하는 연구를 수행하였다.
${\diamondsuit}$ 연구개발내용 및 방법
연구의 수행된 내용은 3가지의 대주제로 구성되어 있다:
1. Glutaryl-7-ACA+CA complex, Glutarate+CA complex의 3차원 X-선 결정구조의 해석과 활성부위에서 기질의 결합에 관여하는 아미노산 분석
2. 기질과 CA 활성부위 아미노산의 상호작용을 바탕으로 CPC+CA Complex 구조 모델링
3. Virtual mutagenesis와 단백질공학을 이용하여 CPC에 대해 활성이 증가된 CA의 제조
${\diamondsuit}$ 기대효과
기질 (Glutaryl-7ACA)이 결합된 CA의 X-선 결정구조분석을 통하여 활성부위에 CPC가 결합하였을 때에 반응성을 향상시킬 수 있는 CA를 단백질공학을 이용하여 제조할 수 있는 이론과 실제를 본 연구를 통하여 보였다. 이러한 연구를 바탕으로 CPC에 대한 반응성이 증진된 CA 효소는 CPC의 7-ACA로의 생변환 공정에 산업적으로 이용되어서 CA만을 이용한 단일 효소공정에 의해 7-ACA의 생산을 가능하게 할 것이다

Abstract ▼

Research purpose
Semisynthetic cephalosporins are primarily synthesized from 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA), which is obtained by environmentally toxic chemical deacylation of cephalosporin C (CPC). Thus, the enzymatic conversion of CPC to 7-ACA by cephalosporin acylase (CA) would be of grea

Research purpose
Semisynthetic cephalosporins are primarily synthesized from 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA), which is obtained by environmentally toxic chemical deacylation of cephalosporin C (CPC). Thus, the enzymatic conversion of CPC to 7-ACA by cephalosporin acylase (CA) would be of great interest. However, CAs use glutaryl-7-ACA (GL-7-ACA) as a primary substrate and the enzyme has low turnover rates for CPC. Therefore, we try to design a new CA that carry higher deacylation activity to CPC so that it can be used in producing 7-ACA in industry. As a first step, CA structures in complex with GL-7-ACA (substrate) and glutarate (side chain) are determined and its binding interactions between active-site residues are analyzed. In addition, active-site residues are mutagenenized to various amino acids in order to understand rational of substrate specificity of CA.
Results
The binary complex structures of cephalosporin acylase with GL-7-ACA and glutarate (the side-chain of GL-7-ACA) show extensive interactions between the glutaryl moiety of GL-7-ACA and the seven residues that form the side-chain pocket. These interactions explain why the D-${\alpha}$-aminoadipyl side-chain of CPC yields a poorer substrate than GL-7-ACA. We mutagenized active-site residues to improve deacylation activity to CPC and identified mutant CAs with higher deacylation activity compared to wild-type.
Conclusion
This understanding of the nature of substrate specificity may be useful in the design of an enzyme with an improved performance for the conversion of CPC to 7-ACA. Additionally, the catalytic mechanism of the deacylation reaction was revealed by the ligand bound structures.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 목차...3
• I. 연구개발결과 요약문...4
• (한글) 세파계 항생제의 원료물질(7-ACA)을 cephalosporin acylase에 의해 생산하기 위한 효소의 구조생물학적 연구...4
• (영문) A structural study on cephalosporin acylase to produce 7-ACA by enzymatic process...5
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...6
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...6
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...9
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...36
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...37
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...38
• 6. 첨부서류...39
• 7. 참고문헌...39