초록 ▼

현재 간흡충증은 우리나라에서 감염율이 가장 높은 기생충성 질환이며 약 70-80만 명의 감염자가 있는 것으로 추산됨. 간흡충증은 만성적 경과를 취해서 유행지 주민들의 건강을 위협하는 풍토병임. 따라서 간흡충 감염의 조기 진단과 치료가 매우 중요함. 간흡충 감염자에 대한 혈청학적 진단에서 각 항원 단백질들은 특이도는 우수하였으나 민감도가 낮았음. 특히, 감염부하가 낮은 환자에 대한 진단율이 낮음. 이 문제점을 개선하기 위하여 민감도와 특이도가 높은 혈청학적 진단용 항원이 필요함. 민감도는 낮지만 특이도가 높은 재조합 단백질을 분자생물

현재 간흡충증은 우리나라에서 감염율이 가장 높은 기생충성 질환이며 약 70-80만 명의 감염자가 있는 것으로 추산됨. 간흡충증은 만성적 경과를 취해서 유행지 주민들의 건강을 위협하는 풍토병임. 따라서 간흡충 감염의 조기 진단과 치료가 매우 중요함. 간흡충 감염자에 대한 혈청학적 진단에서 각 항원 단백질들은 특이도는 우수하였으나 민감도가 낮았음. 특히, 감염부하가 낮은 환자에 대한 진단율이 낮음. 이 문제점을 개선하기 위하여 민감도와 특이도가 높은 혈청학적 진단용 항원이 필요함. 민감도는 낮지만 특이도가 높은 재조합 단백질을 분자생물학적 수준에서 생산하고 복합항원을 제조하여 혈청학적 진단에 사용하고자 하였음.
간흡충 cDNA library 제작하고 간흡충 특이 IgG 항체로 immunoscreening하여 양성 클론 45개를 정제하였음. 양성클론 중에서 open reading frame이, 완전하고 pBlueScript에서 발현되는 단백질이 간흡충 감염혈청에 대하여 양성 반응하는 10개를 선별하였음. 선별된 cDNA클론은 elongation factor-1 (EF-1), myosin regulatory light chain (MRLC), methylcrotonyl CoA carboxylase (CXL), tolloid (TLD), tropomyosin (Tm), phosphoglycerate kinase (PGK), 28 kDa glutathion S-transferase (28GST), 26 kDa glutathion S-transferase (26GST), migratory cell protein (MCP), repeatitive protein (RP)이었음. 재조합 단백질로 발현시키기 위하여 선별된 cDNA클론의 coding region을 발현벡터에 subcloning하고 대장균을 형질 변형시켰음. 대장균 배양액에 IPTG를 첨가하여 재조합 단백질을 융합단백질 형태로 발현시키고 친화성칼럼을 사용하여 정제하였음. 간흡충증, 폐흡충증, 유구낭미충증, 스파르가눔증 환자 혈청과 정상인의 혈청에 대하여 immunoblotting으로 재조합 단백질의 항원성을 검정하였음.
단일항원을 SDS-PAGE로 전개시키고 immunoblotting하였을 때, 재조합 단백질 Cs28GST와 Cs26GST는 간흡충 환자혈청 30% 및 10% 양성 반응하였으며 다른 기생충 감염환자 및 대조군 혈청과 교차반응하지 않았음. 이 재조합 단백질들은 특이도가 높았으며 민감도는 낮았음. CsRP는 간흡충 환자혈청 80%와 양성 반응하였으며 다른 기생충 감염환자 및 대조군 혈청 12 - 2l%와 교차 반응하였음. 재조합 단백질 CsMRLC, CsCXL, CsTLD, CsTm, CsMCP는 간흡충증 활자혈청 25 - 45%와 양성 반응하였으며 다른 기생충 환자 혈청 10-43%와 교차 반응하였음. 재조합 단백질 CsEF-1과 CsPGK는 간홉충증 환자 혈청 뿐 만아니라 다른 기생충감염자혈청 및 대조군 혈청 모두와 교차 반응하였음. 재조합 CsPGK는 진단 kit의 양성 대조군으로 이용할 수 있음.
특이도가 우수한 재조합 단백질 Cs28GST와 Cs26GST 및 CsRP을 혼합하여 복합항원 (cocktail antigen)을 제조하였음. Cs26GST와 Cs28GST의 복합항원은 민감도가 80%이고 특이도는 100%이었음. CsRP와 혼합하여 만든 복합항원은 민감도는 높았지만 특이도가 낮았음. 복합항원 Cs26GST+Cs28GST이 간홉충증에 대한 혈청학적 진단시약으로서 유용성 하였음.

Abstract ▼

Currently clonorchiasis is the most prevalent parasitic infection and the infected peoples are estimated to about seven to eight hundred thousands in number in Korea. Clonorchiasis is a chronic disease threatening health of inhabitants living in endemic areas. It is stressed on the early detection a

Currently clonorchiasis is the most prevalent parasitic infection and the infected peoples are estimated to about seven to eight hundred thousands in number in Korea. Clonorchiasis is a chronic disease threatening health of inhabitants living in endemic areas. It is stressed on the early detection and treatment for human clonorchiasis. When used as single antigen in serodiagnosis of human clonorchiasis, the defined antigenic proteins were of high specificity but not of sensitivity. The antigen preparations showed low detection rates for light worm burden cases. To alleviate this obstacle, it is prerequisite to obtain antigenic proteins of high sensitivity and specificity. This study was pursued to produce recombinant proteins of high antigenic specificity, even with low sensitivity, and to prepare an antigenic cocktail (multiple antigen) by combining those single recombinant proteins.
A cDNA library constructed from adult Clonorchis sinensis was immunoscreenined with C. sinensis-specific IgG antibodies and 45 positive clones were purified. Of the positive clones, 10 clones were selected, for which encoded a full open reading frame and expressed in pBlueScript plasmid a recombinant protein reacting to clonorchiasis patient's sera. The selected clones are of elongation factor-1 (EF-1), myosin regulatory light chain (MRLC), methylcrotonyl CoA carboxylase (CXL), tolloid (TLD), tropomyosin (Tm), phosphoglycerate kinase (PGK), 28 kDa glutathion S-transferase (28GST), 26 kDa glutathion, S-transferase (26GST), migratory cell protein (MCP), repeatitive protein (RP). To induce recombinant protein, the each cDNA was subcloned into an appropriate expression plasmid vector and transformed into E. coli host cells. By adding IPTG to the culture medium, the recombinant protein as a fusion to tag protein was expressed and purified by affinity column chromatography. Antigenicity of the recombinant proteins was evaluated by immunoblotting to patients' sera of clonorchiasis, paragonimiasis, cysticercosis and sparganosis, and to sera of helminth-uninfected control group.
In SDS-PAGE and immunoblotting of single proteins, recombinant Cs28GST and Cs26GST reacted positively with 30% and 10% sera of clonorchiasis, but not with sera of other helminth-infected patients. These two recombinant proteins were highly specific and less sensitive. Recombinant CsRP showed positive reactions with 80% sera of clonorchiasis and cross reactions with 12-21% sera of other helminth-infected patients. Those recombinant proteins CsMRLC, CsCXL, CsTLD, CsTm, CsMCP reacted positively with 25-45% sera of clonorchiasis, and cross-reacted with 10-43% sera of other helminth- infected patients. Recombinant CsEF-1 and CsPGK reacted positively with all sera of clonorchiasis as well as with sera of other helminth-infected patients, even with control sera. The recombinant CsPGK can be employed as a positive control in serodiagnostic kits.
Multiple antigens (cocktail antigens) were prepared by combining recombinant Cs28GST, Cs26GST and CsRP of high antigenic specificity. A multiple antigen Cs26GST+Cs28GST revealed 80% sensitivity and 100% specificity toward sera of helminth-infected patients. Multiple antigens containing recombinant CsRP showed high sensitivity but low specificity. It is proposed that the multiple antigen Cs26GST+CS28GST is an useful serodiagnostic reagent for human clonorchiasis.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 목차...3
• 연구개발사업 최종보고서 요약문...4
• Project Summary...5
• Ⅱ. 연구개발과제 연구결과...7
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표...7
• 2. 연구개발과제의 최종 연구개발 대상 및 방법...10
• 3. 연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...12
• 4. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...27
• 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...30
• 6. 연구개발과제의 활용계획...31
• 7. 첨부서류...32
• 8. 참고문헌...32