초록 ▼

본 연구의 개발 목표는 사람의 색소 건피증(Xeroderma Pigmentosum) 질병과 UV DNA repair endonuclease III의 활성과의 상호 연관성의 규명에 있다. XP의 질병중 type D의 경우 XPD 유전자에 돌연변이가 생겨 기능에 이상이 생긴 단백질이 발현되어 DNA에 생긴 손상을 복구하지 못하는 질병으로 UV에 대해 민감성이 증가하고 피부암으로 진행될 확류이 높아지게 된다. 정상세포와 XPD 환자의 세포로부터 UV endonuclease III를 추출, 정제하는 과정에서 column의 profile이

본 연구의 개발 목표는 사람의 색소 건피증(Xeroderma Pigmentosum) 질병과 UV DNA repair endonuclease III의 활성과의 상호 연관성의 규명에 있다. XP의 질병중 type D의 경우 XPD 유전자에 돌연변이가 생겨 기능에 이상이 생긴 단백질이 발현되어 DNA에 생긴 손상을 복구하지 못하는 질병으로 UV에 대해 민감성이 증가하고 피부암으로 진행될 확류이 높아지게 된다. 정상세포와 XPD 환자의 세포로부터 UV endonuclease III를 추출, 정제하는 과정에서 column의 profile이 다르게 나타나는 것으로 보아 XPD와 UV endonuclease III의 상호 작용이 XP-D 질병에서 손상된 DNA의 복구에 중요한 기능을 하고 있을 것으로 사료된다. 또한 UV endouclease III는 이미 ribosomal protein S3의 유전자로부터 발현된 rpS3와 같은 단백질이다. 따라서 XP-D의 세포에서 rpS3의 기능을 통해 손상된 DNA 복구에 영향을 미치는지를 보는 실험을 수행하였다. XPD와 rpS3는 in vivo와 in vitro에서 상호 작용하고 있으며 특히 XP-D 환자에서 많이 나타나는 돌연변이인 683번째 아미노산인 아르기닌이 트립토판으로 치환되어 있는 경우 두 단백질의 상호 작용이 현저히 감소하였다. 또한 UV에 의해 손상된 DNA에 rpS3와 XPD가 같이 복합체를 이루고 있음을 supershift assay를 통해서 확인하였다. 손상된 DNA에 nuclear extract에 있는 여러 단백질 중에 rpS3와 XPD가 다른 단백질과 함께 작용하고 있음을 배제할 수는 없지만 두 단백질이 함께 작용하고 있음을 확실하다. XPD의 R683W mutant의 경우 손상된 DNA에 XPD mutant는 wild type과 같은 양상으로 존재하고 있지만 rpS3의 binding이 현저하게 감소한 것으로 보아 XP-D 환자에서 나타나는 Nucleotide excision repair(NER)의 결핍 현상이 rpS3가 DNA damage에서 복구의 기능을 못하기 때문에 나타는 증상임을 유추할 수 있다. 이처럼 두 단백질이 직접 DNA repair 기능을 수행할 수 있는지 확인하기 위하여 supershift assay에서 사용한 같은 DNA substrate를 이용하여 DNA의 손상이 복구가 되는지 알아보는 실험을 in vitro에서 수행하였다. rpS3 또는 XPD가 과발현되는 cell lysate를 손상된 DNA와 함께 반응시켰을 때 UV에 의한 손상이 복구가 되는 것으로 확인되었다. XP-D cell에서 XPD 유전자의 과발현은 정상세포의 수준으로 repair가 증가되었지만 rpS3의 과발현은 repair의 수준이 약간 증가되었다. 즉, XPD는 NER 결핍을 완벽하게 보상할 수 있지만 rpS3의 과발현은 NER의 결핍을 일부 보상할 수 있는 것으로 확인되었다. 이들의 in vitro repair가 cell의 UV에 대한 resistance와도 연관이 있는지 확인하기 위하여 XP-D cell에 UV를 조사한 후 MTT assay를 통하여 cell의 survival을 관찰하였다. 역시 XPD의 과발현은 XP-D의 UV resistance를 증가시킬 수 있었지만 rpS3의 과발현은 UV에 대한 resistance가 거의 증가하지 않았다. 이러한 결과로 보아 rpS3가 UV에 의한 DNA의 손상을 복구 시키는데에는 XPD의 기능을 도와 중요한 역할을 수행하고 있음을 확인할 수 있었지만, rpS3가 UV에 의해 생긴 cell의 여러 손상을 완벽하게 복구 할 수는 없는 것으로 생각된다. 즉, 세포가 과도한 양의 UV에 노출되면 단순히 핵안에 있는 DNA만 손상을 입는 것이 아니라 핵외의 세포질에서도 손상이 자극이 여러 신호전달체계중의 일부 pathway가 활성화 또는 비활성화된다. 따라서 rpS3는 여러 pathway중의 하나 또는 그 이상을 복구할 수 있는 기능을 가진 단백질이라 해석된다.

Abstract ▼

The purpose of study is the determination of the relationship between Xeroderma Pigmentosum (XP) and the activity of UV endonuclease III in humans. XP type D (XP-D) patients contain mutation in XPD gene which then express mutant XPD protein. XP-D cells from these patients can not repair UV damaged D

The purpose of study is the determination of the relationship between Xeroderma Pigmentosum (XP) and the activity of UV endonuclease III in humans. XP type D (XP-D) patients contain mutation in XPD gene which then express mutant XPD protein. XP-D cells from these patients can not repair UV damaged DNA and then increase in the sensitivity of UV and the progression of skin cancer. The difference of column chromatography profile during the purification of UV endonuclease III between normal and XP-D lymphoblasts represents that the interaction of XPD with UV endonuclease III plays an important role in damaged DNA repair. It has already been published that UV endonuclease III is identical with ribosomal protein S3. For these reasons, the function of rpS3 in damaged DNA repair was examined in XP-D cells isolated from XP-D patient. From binding assay, it was shown that XPD protein interacted with rpS3 in vivo and in vitro, and that the interaction of XPD mutant (R683W) proteins with rpS3 was decreased. Supershift assay showed that a complex of rpS3 and XPD was assembled onto a UV damaged DNA. In reaction of damaged DNA substrate with nuclear extract, damaged DNA is able to interact with rpS3 and XPD through any other proteins. However, it is certain that three molecules interact with each other. Supershift assay with R683W mutant of XPD showed that this mutant binds to the UV damaged DNA similar to wild type but the binding of rpS3 to the complex remarkably decrease. From these results, it was supposed that nucleotide excision repair (NER) defect in XP-D patients causes dysfunction of rpS3 in UV damaged DNA repair. To determine that XPD and rpS3 directly play a role in DNA repair, XPD or rpS3 overexpressed cells were used in vitro repair assay, in which UV damaged DNA from supershift assay was used as substrate. From in vitro repair assay, it was shown that overexpression of XPD in XP-D cells increased the DNA repair activity to the level of that in normal cells, but overexpression of rpS3 increased a little. These results mean that XPD perfectly complements NER defects in XP-D cells but rpS3 does partially. To investigate the relationship between results of in vitro repair activity and UV resistance of XP-D cells, cell survival was tested through MTT assay after UV irradiation. The result reported that XPD-overexpressed XP-D cells resisted UV irradiation but rpS3-ovrexpressed XP-D cells did not. From these results, it is suggested that rpS3 may play an important role in UV damaged DNA repair with XPD, but not participate in repair pathways responsible for all cellular damages. .When cells are exposed to high dose of UV, cytoplasm as well as DNA is damaged, and then these damages cause activation or inactivation of many pathways. RpS3 may function in more than one of these pathways.

목차 Contents

• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...6
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...6
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...10
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...18
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당)...19
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과...20
• 6. 연구개발결과의 파급효과...24
• 7. 첨부서류...24