초록 ▼

식품 중의 잔류농약에 대한 국민들의 우려가 높아지고 있으며 따라서 농약분석의 효율성을 높이고 농약 규제 범위를 넓히기 위한 노력이 요구된다. 농약 검출에 사용되는 기존의 크로마토그래피 분석법은 감도와 정확도가 높다는 장점을 가지는 반면에 장시간의 복잡한 과정과 고액의 경비가 요구된다는 단점을 가진다. 본 연구에서는 기존의 농약분석법의 단점을 보완할 수 있는 면역분석법(제1 세부과제)과 효소분석법(제2 세부과제)을 개발하여 잔류농약의 규제범위의 확대에 기여 하고자 한다.
<제1 세부과제> 본 과제의 목표는 주요 농약검사 대상 유

식품 중의 잔류농약에 대한 국민들의 우려가 높아지고 있으며 따라서 농약분석의 효율성을 높이고 농약 규제 범위를 넓히기 위한 노력이 요구된다. 농약 검출에 사용되는 기존의 크로마토그래피 분석법은 감도와 정확도가 높다는 장점을 가지는 반면에 장시간의 복잡한 과정과 고액의 경비가 요구된다는 단점을 가진다. 본 연구에서는 기존의 농약분석법의 단점을 보완할 수 있는 면역분석법(제1 세부과제)과 효소분석법(제2 세부과제)을 개발하여 잔류농약의 규제범위의 확대에 기여 하고자 한다.
<제1 세부과제> 본 과제의 목표는 주요 농약검사 대상 유기인계 농약인 diazinon, chlorpyrifos, fenitrothion 및 pirimiphos-methyl에 대한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 개발하는 것이다. 1. Diazinon에 대한 ELISA. Diazinon에 대해 bridge의 구조가 다른 4종류의 hapten을 합성하여 그 중 하나의 hapten에 KLH를 결합하여 면역원으로 사용하였으며 hapten에 OVA를 결합하여 코팅항원으로, HRP를 결합하여 enzyme tracer로 사용하였다. 토끼에 면역원을 주사하여 복클론(polyclonal) 항체를 얻었다. 단클론(monoclonal)항체를 얻기 위하여 BALB/C 마우스를 면역화 하였으며 최고의 역가를 나타내는 마우스의 비장세포를 형질세포종세포(myeloma cell)(SP2/0)와 융합하여 클로닝함으로써 농약에 대해 특이성을 보이는 3종의 교잡세포주(hybridoma)를 얻었다. 이들 교잡세포주에서 생성된 항체들을 미용하여 간접경쟁 ELISA와 직접경쟁 ELISA를 개발하였다. 배양 삼등액의 희석배수, 코팅항원의 종류와 양, blocking agent의 종류, 반응용액 중의 유기용매 함량, 이온 강도 및 pH 등에 대해 최적화하였으며 최적화한 간접경쟁 ELISA의 $IC_{50}$ 값(최고 감응을 50% 저해시키는 분석물의 농도)은 4 ng/mL이었고 검출한계(10% 저해)는 0.7 ng/mL이었다. 유사한 과정으로 최적화한 직접경쟁 ELISA의 $IC_{50}$ 값은 6ng/mL이었고 검출한계는 0.9 ng/mL이었다. 구조가 유사한 다른 유기인계 농약들에 대한 단클론 항체의 교차반응성은 간접경쟁과 직접경쟁 ELISA 모두 2% 이하로 나타났다. 실제 농상물 시료(쌀, 상치)에 diazinon을 spike한 다음 본 연구에서 개발한 ELISA를 이용하여 회수율을 조사해보니 78-228%로 나타났다. 2) Fenitrothion에 대한 ELISA. 4종의 hapten을 합성하여 diazinon의 경우와 유사한 방법으로 단클론 항체를 얻었다. 간접경쟁 ELISA의 $IC_{50}$ 값은 14 ng/mL이었고 검출한계는 3.1 ng/mL이었다. 직접경쟁 ELISA의 $IC_{50}$ 값은 21 ng/mL이었고 검출한계는 2.9 ng/mL 이었다. 다른 유기인계 농약들에 대한 단클론 항체의 교차반응성은 두 ELISA 모두에서 11% 이하로 나타났다. 3) Pirimiphos0methyl에 대한 ELISA. 2종의 hpaten을 합성하여 diazinon의 경우와 유사한 방법으로 단클론 항체를 얻었다. 간접경쟁 ELISA의 $IC_{50}$값은 약 70 ng/mL이었으며 검출한계는 10 ng/mL이었다. 4) Chlorovrifos에 대한 ELISA. 2종류의 hapten을 합성하여 항체를 얻었으나 항체의 chlorpyrifos에 대한 특이성이 ELISA에 적합하지 않았으므로 새로운 hapten의 합성이 요구된다.
<제2 세부과제> 본 과제의 목표는 유기인계와 카바메이트계 농약을 총체적으로 검출하는 dipstick형 kit의 개발이다. 본 kit는 cholinesterase(ChE)가 유기인계와 카바메이트계 농약에 의해 활성이 저해되며 저해정도가 농약의 농도에 의존한다는 원리에 근거한다. 즉 효소의 저해정도를 알아냄으로써 농약을 검출할 수 있다. 본 kit는 ChE를 membrane에 고정화시킨 strip을 사용하며 strip을 농약이 함유된 시료용액에 넣어 효소를 저해시킨 다음 발색성 기질 용액에 넣어 발색시켜 발색의 정도를 측정하는 과정을 거친다. kit 개발과정과 결과는 다음과 같았다. 1) 효소 고정화. plastic sheet(0.7×6 cm) 하단에 membrane(0.7×0.7 cm)을 부착한 후 적정 농도로 희석한 acetylcholinesterase(AchE)를 membrane 중앙에 점적하여 test strip을 제작하고 30분간 건조시키는 과정을 수립하였다. 2) 효소를 고정화할 membrane과 효소 기질 선정. membrane으로 6종 즉 nitrocellulose, Immobilon(PVDF), Immunodyne ABC Biodyne B, Ultrabind 및 Hybond $N^{+}$를 사용하고 기질로서 4종 즉 indophenyl acetate, 2,6-dichloroindophenyl acetate, indoxyl acetate 및 N-methlindoxyl acetate를 사용하여 membrane과 기질의 모든 조합에 대해 control assa(무농약) 하여 그 결과를 비교하였다. 비교적 높은 signal/background 비를 근거로 membrane을 Hybond $N^{+}$가, 효소 기질로는 indophenyl acetate와 indoxyl acetate가 최적인 것으로 판단되었다. 3) assa 프로토콜 수립. assay 조건을 여러 가지로 달리하면서 control assay를 하여 그 결과를 비교함으로써 프로토콜을 최적화하였다. membrane에 점적할 acetylcholinesterase(AChE)의 양은 1000 unit/ml 용액 3 μL가 적절하였다. 기질을 녹이기 위한 유기용매로는 5%의 methanol이 최적이었다. 효소기질의 최적 농도는 indophenyl acetate의 경우에 2 mM, indoxyl acetate의 경우에 1mM이었다. 효소 저해 incubation 시간은 60분, 발색 incubation 시간은 10-15분이 최적이었다. 4) kit를 사용한 농약 분석. parathion 표준용액에 대해 검량 곡선을 수립하였는데 검출가능 농도범위는 $10^{-6}$-$10^{2}$ ㎍/mL이었다. 농약을 산화시킬 경우에 감도는 비슷하였으나 농약 농도와 발색과의 관계는 보다 비례적이었다. 본 kit는 당초에 효소 부위 상부에 반응 생성물의 항체를 띄 모양으로 고정화하여 생성물이 항체 부위에서 농축되게 함으로써 색깔 변화를 명확하게 알 수 있게 하고자 하였다. 효소반응 생성물에 대한 2종의 hpten을 합성하여 복클론 및 단클론 항체를 생산한 다음 이들 항체를 코팅한 strip을 사용하여 assay해 보았다. 불행히도 효소반응 생성물이 membrane 상에서 이동하지 않았으므로 이 문제점을 해결하기 위한 추가적인 연구가 요구된다. 본 kit는 농약 검사기관과 농산물 생산 및 판매 현장에서 사용 가능하므로 농산물의 안전성 관리의 확대에 기여할 것으로 기대된다. 또한 개발한 분석법의 상품화에 의한 경제적 이익이 기대된다.

Abstract ▼

There is increasing public concern for pesticide residues in food and, thus, growing demands for increased analytical capability and capacity in pesticide residue monitoring. Detection of pesticide residues in food has relied on chromatographic techniques, which is sensitive and accurate, but labori

There is increasing public concern for pesticide residues in food and, thus, growing demands for increased analytical capability and capacity in pesticide residue monitoring. Detection of pesticide residues in food has relied on chromatographic techniques, which is sensitive and accurate, but laborious, time-consuming and expensive. The objective of this research is the development of immunoassays(1 st part) and enzymatic methods(2nd part) for use as alternative pesticide detection methods that can resolve the shortcomings of the current pesticide analysis methods.
<1st part of the project> The objective of this study is the development of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the detection of diazinon, chlorpyrifos, fenitrothion and pirimiphos-methyl which are the main-target organophosphorus pesticides. 1. ELISA for diazinon. Four diazinon haptens, which differ in the bridge structure, were synthesized and one of them was conjugated to KLH for use as the immunogen. The four haptens were conjugated to OVA and HRP for use as coating antigens and enzyme tracers, respectively. Polyclonal antibodies were obtained from rabbits by immunization with the immunogen. To obtain monoclonal antibodies, spleen cells of BALB/C mouse which was immunized with the immunogen were fused with myeloma cells(SP2/0). Three Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies with the highest affinity were finally chosen. Using the antibodies from the hybridomas, an indirect and a direct competitive ELISA were developed. The indirect ELISA was optimized with regard to the dilution of the supernatant of the cell culture, kind and amount of the coating antigen, kind of blocking agent, composition of assay solution (concentration of organic cosolvent and Tween 20, ionic strength and pH). The optimized indirect ELISA showed an $IC_{50}$(concentration giving 50% inhibition of the maximum response) of 4 ng/mL with detection limit(10% inhibition) of 0.7 ng/mL. The $IC_{50}$ value of the direct ELISA similarly optimized was 6 ng/mL with a detection limit of 0.9 ng/mL. Cross-reactivity of the antibody to other organophosphorus pesticides in both ELISAs were less than 2%. The recovery of diazinon spiked into agricultural products(rice and lettuce) determined by the ELISA. was satisfactory(78-228%). 2) ELISA for fenitrothion. Four fenitrothion haptens were synthesized and monoclonal antibodies were obtained by the same procedure as that, for diazinon. The indirect ELISA showed an $IC_{50}$ of 14 ng/mL with a detection limit(10% inhibition) of 3.1 ng/mL. The direct ELISA showed an $IC_{50}$ value 21 ng/mL with a detection limit of 2.9 ng/mL. Cross-reactivity of the antibody to other organophosphorus pesticides in both ELISA were less than 11%. 3)ELISA for pirimiphos-methyl. Two pirimiphos-methyl haptens were synthesized and monoclonal antibodies for this pesticide were obtained by the same procedure as that for diazinon. The indirect ELISA showed an $IC_{50}$ of 70 ng/mL with a detection limit(10% inhibition) of 10 ng/mL. 4) ELISA for chlorpyrifos. Two chlorpyrifos haptens were synthesized, but the monoclonal antibodies obtained did not show a specificity to chlorpyrifos suitable for an ELISA. Synthesis of new haptens are required.
<2nd part of the project> The objective of this study is the development of a dipstick-type kit for the class-specific determination of organophosphorus and carbamate pesticides. The principle of this kit is based on the fact that cholinesterase(ChE) is inhibited by organophosphorus and carbamate pesticides and the degree of inhibition is dependent on the concentration of the pesticide. A pesticide can be determined by measuring the inhibition of the enzyme by the pesticide. This kit uses a test strip made with a ChE-immobilized membrane. The assay involves inhibition of the enzyme by incubation of the enzyme-coated strip in the pesticide-containing sample and measurement of color development after incubation of the strip in the chromophoric enzyme substrate. The procedures used and the results observed in the kit development were as follows. 1) Enzyme immobilization. A section of membrane cut into square pieces (0.7x0.7 cm) was mounted onto a polystyrene plastic strip(0.7x6 cm) and the diluted acetylcholinesterase(AChE) was spotted on the center of the membrane and then the strip was dried for 30 min. 2) Selection of membrane and enzyme substrate. The membranes tested for immobilizing AChE were nitrocellulose, Immobilon(PVDF), Immunodyne ABC, Biodyne B, Ultrabind and Hybond $N^{+}$, and the enzyme substrates tested were indophenyl acetate, 2,6-dichloroindophenyl acetate, indoxyl acetate and N-methylindoxyl acetate. From the control assays(no pesticide) for all the combinations of the membranes and the substrates, Hybond N$N^{+}$ and, indophenyl acetate and indoxyl acetatete were selected as candidates for the most suitable membrane and enzyme substrate, respectively, based on relatively high signal/background ratio. 3) Establishment of assay protocol. The assay protocol was optimized by comparing the results of control assays under various assay conditions. The optimum quantity of AChE to be spotted on the membrane was 3 μL of 1000 unit/mL enzyme solution. The optimum organic cosolvent for dissolving the pesticide solution was methanol(5%). The optimum concentration of substrate was 2 mM for indophenyl acetate and 1 mM for indoxyl acetate. The optimum incubation time for enzyme inhibition and color development was 60 and 10-15 min, respectively. 4) Pesticide detennination using the kit. A calibration graph for parathion standard was obtained. The dynamic range was $10^{-6}$-$10^{2}$ ㎍/mL. Oxidation of the pesticide caused no significant effect on assay sensitivity, but allowed more linear relationship beteen the pesticide concentration and the degree of inhibition. This kit was initially designed to coat an antibody band above the immobilized enzyme on the membrane to concentrate the product of the enzyme reaction, which would make the color development more distinct. Polyclonal and monoclonal antibodies against the product of the enzyme reaction were prepared and assays were perfonned using the antibody-coated strip. Unfortunately, the product was found to be immobile on the membrane. Therefore a further study is needed to solve this problem. The kits developed in this study are expected to be used in pesticide monitoring at the official pesticide-regulation agencies as well as at the places where agricultural products are produced and marketed, which will help expand the scope of current pesticide monitoring. These kits are also expected to be commercialized for economic profits.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 목차...3
• I. 연구개발결과요약문...12
• 한글요약문...12
• SUMMARY...14
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...16
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...16
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표...16
• 1.1.1 연구의 배경...16
• 1.1.2. 연구의 필요성...17
• 1.1.3. 연구의 목표 및 범위...18
• 1) 최종 목표...18
• 2) 연차별 목표...18
• 1.1.4. 연구과제의 구성 및 추진체계...19
• 1.1.5. 연차별 연구 추진계획...20
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...21
• 1.2.1. 연구목표의 달성도...21
• 1.2.2. 기대효과...21
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용, 결과 및 고찰...22
• 2.1. 제1 세부과제...22
• 2.1.1. 연구의 개요 및 원리...22
• 2.1.2. 연구의 내용 및 방법...24
• 1) 농약의 hapten 합성...24
• 2) Hapten-protein conjugate의 합성...24
• 3) Polyclonal 항체 생산...25
• 4) Monoclonal 항체 생산...25
• 5) ELISA의 수립...25
• 6) 항체의 농약 관련물질에 대한 교차반응성(cross-reactivity) 조사...26
• 7) 개발한 ELISA를 사용한 실제 시료의 분석...26
• 2.1.3. 연구의 결과 및 고찰...26
• 1) Diazinon에 대한 ELISA 개발...26
• 2) Fenitrothion에 대한 ELISA 개발...27
• 3) Pirimiphos-methyl에 대한 ELISA 개발...28
• 4) Chlorpyrifos에 대한 ELISA 개발...28
• 2.2. 제2세부과제...29
• 2.2.1 연구의 개요와 원리...29
• 2.2.2. 연구방법...29
• 1) Dipstick형 농약검출 kit의 프로토콜 수립...29
• 2) 효소반응 생성물의 hapten 합성과 항체 생산...30
• 3) Dipstick형 농약 검출법 프로토콜의 최적화...30
• 4) Dipstick형 농약검출법의 성능과 실용성 조사...31
• 5) Dipstick형 검출 시스템의 kit화...31
• 2.2.3. 연구내용, 결과 및 고찰...32
• 1) 효소반응 생성물의 hapten 합성과 항체 생산...32
• 2) Dipstick형 농약검출 kit의 assay 프로토콜의 수립...32
• 3) 검출 strip의 성능과 실용성 조사...33
• 4) Dipstick형 검출 시스템의 kit화...34
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과에 대한 결론...35
• 3.1. 제1 세부과제...35
• 3.2. 제2 세부과제...36
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과...38
• 4.1 총괄연구개발과제의 연구결과...38
• 4.1.1. 연구(학술)성과...39
• 4.1.2. 기타성과...41
• 5. 첨부서류...42
• III. 제1세부연구개발과제 연구결과...59
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...59
• 1.1 제1세부연구개발과제의 목표...59
• 1.1.1. 연구의 목표 및 범위...59
• 1) 최종 목표...59
• 2) 연차별 목표...59
• 1.2. 제1세부연구개발과제의 목표달성도...59
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...60
• 2.1. Diazinon의 ELISA 개발...60
• 2.1.1. 연구대상...60
• 2.1.2. ELISA의 원리...60
• 2.1.3. 실험 재료 및 기기...62
• 2.1.4. 면역원, 코팅항원 및 enzyme tracer의 합성...62
• 1) Hapten 디자인 및 합성...62
• 2) Hapten-protein conjugate 합성...67
• 2.1.5. 복클론 항체 생산...69
• 1) 면역화...69
• 2) 항혈청의 역가 측정...69
• 3) Carrier Protein에 대한 항혈청의 비특이적인 결합 측정...69
• 4) 항혈청의 경쟁 스크리닝...69
• 2.1.6. 단클론 항체 생산...70
• 1) 면역화...70
• 2) 항혈청의 역가 측정...70
• 3) Mouse feeder cell 준비...70
• 4) Myeloma cell 준비...71
• 5) Spleen Cell 준비...71
• 6) 세포융합...71
• 7) Hybridoma의 선택과 Cloning...71
• 8) 복수(ascites)...72
• 2.1.7. 간접경쟁 ELISA의 수립...73
• 1) Assay 최적화...73
• 2) 간접경쟁 ELISA의 검량곡선 수립...74
• 3) 간접경쟁 ELISA의 교차반응성...74
• 2.1.8. 직접경쟁 ELISA의 수립...75
• 1) Assay 최적화...75
• 2) 직접경쟁 ELISA의 검량곡선 수립...76
• 3) 직접경쟁 ELISA의 교차반응성 조사...76
• 2.1.9. 농산물에 첨가된(spiked) diazinon의 회수율(recovery) 측정...76
• 2.2. Fenitrothion의 ELISA 개발...77
• 2.2.1. 연구대상...77
• 2.2.2. 면역원, 코팅항원 및 enzyme tracer의 합성...77
• 1) Hapten 디자인 및 합성...77
• 2) Hapten-protein conjugate 합성...78
• 2.2.3. 단클론 항체의 생산...78
• 2.2.4. 간접경쟁 ELISA의 수립...78
• 1) 항체의 희석배수와 코팅항원의 종류 및 양...78
• 2) 간접경쟁 ELISA의 겸량곡선...78
• 3) 간접경쟁 ELISA의 교차반응성...78
• 2.2.5. 직접경쟁 ELISA의 수립...79
• 1) 항체의 희석배수와 Enzyme tracer의 종류와 양...79
• 2) 직접경쟁 ELISA의 검량곡선...79
• 3) 직접경쟁 ELISA의 교차반응성...79
• 2.3. Pirimiphos-methyl의 ELISA 개발...79
• 2.3.1. 연구대상...79
• 2.3.2. 면역원, 코팅항원 및 enzyme tracer의 합성...79
• 1) Hapten 디자인 및 합성...79
• 2) Hapten-protein conjugate 합성...82
• 2.3.3. 단클론 항체의 생산...82
• 1) 면역화...82
• 2) 항혈청의 역가 측정...83
• 3) 세포융합 및 cloning...83
• 4) 단클론성 항체 생산과 정제...84
• 2.3.4. 간접경쟁 효소면역분석법 확립...84
• 1) 코팅항원 종류 및 농도...84
• 2) 코팅항원에 대한 항체의 친화도...84
• 3) Assay 최적화...85
• 4) Primiphos-methyl에 대한 ELISA의 표준곡선 확립...86
• 2.4. Chlorpyrifos의 ELISA 개발...86
• 2.4.1. 연구대상...86
• 2.4.2. 면역원, 코팅항원의 합성...86
• 1) Hapten 디자인 및 합성...86
• 2) Hapten-protein conjugate 합성...89
• 2.4.3. 단클론 항체의 생산...89
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 및 고찰...90
• 3.1. Diazinon의 ELISA 개발...90
• 3.1.1. Hapten 디자인 및 합성...90
• 3.1.2. 단클론 항체를 사용한 ELISA 개발...90
• 1) 면역화 및 항혈청의 역가 측정...90
• 2) 코팅 단백질에 대한 항혈청의와 코팅항원의 종류 및 양 결정...91
• 3.1.3. 단클론 항체의 생산...92
• 1) 항혈청의 역가 측정...92
• 2) 세포융합...93
• 3.1.4. 간접경쟁 ELISA의 수립...93
• 1) 코팅 단백질에 대한 비특이적인 결합...93
• 2) 항체의 희석배수와 코팅항원의 종류 및 양...94
• 3) Assay 최적화...94
• 4) 간접경쟁 ELISA의 검량곡선 수립...98
• 5) 간접경쟁 ELISA의 교차반응성...99
• 3.1.5. 단클론 항체를 이용한 직접경쟁 ELISA의 수립...101
• 1) Enzyme tracer의 종류 및 농도...101
• 2) Enzyme tracer 제조시의 Hapten/HRP의 몰비...101
• 3) Assay 최적화...102
• 4) 직접경쟁 ELISA의 검량곡선 수립...105
• 5) 직접경쟁 ELISA의 교차반응성...106
• 3.1.6. 개발한 ELISA에 의한 농산물 중에 첨가된 diazinon익 회수율...108
• 3.2. Fenitrothion의 ELISA 개발...108
• 3.2.1. Hapten의 합성 및 디자인...108
• 3.2.2. 면역화 및 항혈청의 역가...109
• 3.2.3. 세포융합...109
• 3.2.4. 간접경쟁 ELISA의 수립...110
• 1) 항체의 희석배수와 코팅항원의 종류 및 양...110
• 2) 간접경쟁 ELISA의 검량곡선 수립...111
• 3) 교차반응성에 의한 항혈청의 특이성...112
• 3.2.5. 직접경쟁 ELISA의 수립...114
• 1) 항체의 희석배수와 enzyme tracer의 종류 및 양...114
• 2) 직접경쟁 ELISA의 검량곡선 수립...115
• 3) 교차반응성에 의한 항혈청의 특이성...116
• 3.3. Pirimiphos-methyl의 ELISA 개발...118
• 3.3.1. Hapten 합성 및 디자인...118
• 3.3.2. 면역화 및 항혈청의 역가 측정...118
• 3.3.3. 세포융합 및 cloning...118
• 3.3.4. 단클론성 항체의 특성...120
• 3.3.5. 간접경쟁 ELISA의 확립...120
• 1) 코팅 항원 및 농도...120
• 2) 코팅 항원에 대한 항체의 친화도...121
• 3) 코팅 조건...121
• 4) Plate의 blocking...122
• 5) 경쟁조건...122
• 6) 2차 항체 (anti-mouse-IgG-HRP conjugate) 희석배수...123
• 7) 유기용매의 종류 및 농도...123
• 8) Primiphosmethyl에 대한 ELISA의 표준곡선 확립...124
• 3.4. Chlorpyrifos의 ELISA 개발...125
• 3.5. Plate형 ELISA 시스템의 kit화...126
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...127
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과...129
• 5.1 제1세부연구개발과제의 연구결과...129
• 6. 참고문헌...133
• 7. 첨부서류...137
• IV. 제2세부연구개발과제 연구결과...153
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...153
• 1.1 제2세부연구개발과제의 목표...153
• 1.1.1 연구의 배경...153
• 1.1.2. 연구의 필요성...153
• 1.1.3 연구의 목적...154
• 1.1.4 연구의 범위...154
• 1.2. 제2 세부연구개발과제의 목표달성도...155
• 2. 제2 세부연구개발과제의 연구내용 및 방법...155
• 2.1. 연구의 내용과 원리...155
• 2.2 Dipstick형 농약검출 kit의 프로토콜 수립...156
• 2.2.1 Test strip의 준비...156
• 2.2.2 Assay 프로토콜...156
• 2.2.3 Dipstick assay 결과의 평가방법...156
• 2.3. 실험재료 및 방법...158
• 2.3.1 주요시약 및 재료...158
• 2.3.2. 효소반응 생성물의 hapten 합성과 항체 생산...158
• 1) 효소반응 생성물의 hapten 합성...158
• 2) 효소반응 생성물에 대한 항체 생산...159
• 2.4 Dipstick형 검출 kit의 최적화...162
• 2.4.1 항체를 이용한 프로토콜의 최적화...162
• 1) Membrane의 종류 선정...162
• 2) 기질의 선정...162
• 3) 기질 농도의 최적화...162
• 4) Acetylcholinesterase(AchE) 점적량의 최적화...163
• 5) 기질용매 종류의 선택...163
• 6) 기질용매 농도의 최적화...163
• 7) 기질 용액 발색 시간의 최적화...163
• 2.4.2 항체를 사용하지 않은 프로토콜의 최적화...163
• 1) Membrane의 종류 선정...163
• 2) Blocking이 미치는 영향...163
• 3) Acetylcholinesterase(AchE) 농도와 양 결정...164
• 4) 기질의 선정...164
• 5) 기질 농도에 따른 영향...164
• 6) 기질 용액 발색 시간에 따른 차이...164
• 7) 기질 용매의 종류와 함량의 선택...164
• 2.5 검출 strip의 성능과 실용성 조사...164
• 2.5.1 검출 strip을 이용한 표준용액의 분석...164
• 2.5.2 유기인계 농약의 산화에 의한 검출법의 감도 향상 시험...165
• 2.5.3 검출 strip을 식품시료 분석에 적용...165
• 2.5.4 검출 strip 시스템의 kit화...165
• 3. 제2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...165
• 3.1 효소반응 생성물의 hapten 합성과 항체 생산...165
• 3.1.1 효소반응 생성물의 hapten 합성...165
• 1) Hapten M 합성 결과...165
• 2) Hapten N의 합성 결과...166
• 3.1.2 효소반응 생성물에 대한 항체 생산...166
• 1) monoclonal antibody의 생산...166
• 2) polyclonal antibody의 생산...167
• 3.2 Dipstick형 검출 assay의 최적화...168
• 3.2.1 항체를 이용한 프로토콜의 최적화 실험 결과...168
• 1) Membrane의 선정...168
• 2) 기질의 선정...168
• 3) 기질 농도의 최적화...169
• 4) Acetylcholinesterase(AchE) 점적량의 최적화...169
• 5) 기질 용매의 선택...170
• 6) 유기 용매 농도의 최적화...170
• 7) 기질 용액 발색 시간의 최적화...170
• 3.2.2. 항체를 사용하지 않은 프로토콜의 최적화...171
• 1) 기질의 선정...171
• 2) Membrane의 종류 선정...172
• 3) Acetylcholinesterase(AchE) 농도와 양 결정...173
• 4) Blocing이 미치는 영향...174
• 5) 기질 농도선택을 위한 실험...175
• 6) 기질 용액 발색 시간의 선택을 위한 실험...177
• 7) 기질용매의 선정...178
• 8) 유기용매 농도의 선택을 위한 실험...179
• 3.3 검출 strip의 성능과 실용성 조사...180
• 3.3.1. Dipstick형 잔류농약 검출 assay에 의한 표준용액의 분석...180
• 3.3.2 유기인계 농약의 산화에 의한 검출법의 감도 향상 시험...182
• 3.3.3 검출 strip을 식품시료 분석에 적용...184
• 3.3.4 Dipstick형 검출 system의 kit화...185
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...186
• 4.1 효소반응 생성물의 hapten 합성과 항체 생산...186
• 4.1.1 효소반응 생성물의 hapten 합성...186
• 4.1.2 효소반응 생성물에 대한 항체 생산...186
• 1) 단클론 항체(monoclonal antibody)의 생산...186
• 2) 단클론 항체(polyclonal antibody)의 생산...186
• 4.2. Dipstick형 검출법의 최적화...187
• 4.2.1 항체를 이용한 프로토콜의 최적화 실험 결과...187
• 1) 효소와 항혈청 고정화용 membrane의 선정...187
• 2) 기질의 종류와 적정 농도의 선정...188
• 3) Acetylcholinesterase(AchE) 점적량의 결정...188
• 4) 기질용매의 종류와 농도의 선택...188
• 5) 기질 용액 발색 시간의 최적화...189
• 4.2.2. 항체를 사용하지 않은 프로토콜의 최적화...189
• 1) AchE 효소 기질의 선정...189
• 2) Membrane의 종류 선정...189
• 3) Acetylcholinesterase(AchE) 농도와 양 결정...190
• 4) Blocking이 미치는 영향...190
• 5) 기질 농도에 따른 영향...191
• 6) 기질 용액 발색 시간에 따른 차이...191
• 7) 유기용매 종류와 농도의 선정...191
• 4.3 검출 strip의 성능과 실용성 조사...192
• 4.3.1. Dipstick형 잔류농약 검출 assay에 의한 표준용액의 분석...192
• 4.3.2 유기인계 농약의 산화에 의한 검출법의 감도 향상 시험...192
• 4.3.3 검출 strip을 식품시료 분석에 적용...192
• 4.3.4 Dipstick형 검출 시스템의 kit화...193
• 4.4 결론...193
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과...194
• 5.1 제2세부연구개발과제의 연구결과...194
• 5.1.1. 연구(학술)성과...195
• 5.1.2. 개발(산업)성과...197
• 6. 참고문헌...198
• 7. 첨부서류...202