[국가R&D연구보고서]교세포 및 호중구에서 아밀로이드 베타형 단백질과 Phospholipase D의 상호작용을 통한 염증반응 및 세포사멸의 조절기전 규명;아밀로이드 단백질과 phospholipase D의 상호작용 및 교세포에서 염증반응 조절기전규명;호중구에서 Aβ에 의한 염증반응 매개물질의 생성이 세포사멸에 미치는 영향과 phospholipase D의 역할에 대한 연구;면역 활성 합성 펩타이드가 아밀로이드 베타 펩타이드의 작용에 미치는 영향 조사 및 그 작용기전 규명 Study on the mechanism of inflammatory reaction and apoptosis mediated by interaction between beta amyloid protein and phospholipase D in astrocytes and neutrophils원문보기
알쯔하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 노인에게 발병율이 높은 치매 질환으로 기억인지기능을 수행하는 뇌부위에 신경세포의 소실로 인해 유발되는 신경퇴행성 질환이다. 아밀로이드 베타 단백질은 AD유발에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 뇌에 염증반응을 동반하는 병력을 가진 환자에게서 AD의 발병율이 높고 염증억제 약물에 의하여 AD의 발병율이 감소한다고 보고되어 있다. phospholipase D(PLD)는 세포막을 구성하고 있는 인지질, 특히 생체막에서 전체 인지질의 60-80%의 상당한 부분을 이루고 있
알쯔하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 노인에게 발병율이 높은 치매 질환으로 기억인지기능을 수행하는 뇌부위에 신경세포의 소실로 인해 유발되는 신경퇴행성 질환이다. 아밀로이드 베타 단백질은 AD유발에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 뇌에 염증반응을 동반하는 병력을 가진 환자에게서 AD의 발병율이 높고 염증억제 약물에 의하여 AD의 발병율이 감소한다고 보고되어 있다. phospholipase D(PLD)는 세포막을 구성하고 있는 인지질, 특히 생체막에서 전체 인지질의 60-80%의 상당한 부분을 이루고 있는 phosphatidylcholine (PC)을 가수분해함으로써 phosphatidic acid (PA)와 choline을 생성하는 인지질 분해효소인데 아미로이드 단백의 과발현이 PLD활성과 발현을 증가시킨다는 것을 밝히고 보고함으로써 뇌신경계의 병리적인 현상에 PLD 매개 신호전달 네트워크가 교세포의 활성화에 중요하게 관여한다는 가능성을 제시해 주고 있다. 본 연구의 목표로는 활성산소유도와 연관된 분자 및 단백질을 통한 신경세포, 교세포 및 호중구와 같은 염증세포의 활성화에 PLB신호전달 경로에 이르는 네트워크를 규명하고 이를 조절하는 신기능 물질을 탐색하여 뇌염증반응을 이해하고 퇴행성 신경질환을 이해하는데 중요한 과학적인 근거를 제공하기 위함이다. 교세포는 뇌염증반응을 매개하는 대표적인 세포로서, 뇌손상 시에 활성화되어 염증매개 물질을 생성하는 세포로 최근에 본 연구자들이, 뇌허혈 및 치매환자들의 뇌에서 PLD단백질의 과발현되어 있음을 처음으로 발견하였으며, 인간의 교세포에서 염증반응을 유도하는 cyclooxfgenase-2 (COX-2) 발현이 phosphelipase D(PLD)를 매개한다는 사실을 관찰하였다. 1세부과제에서는 활성 산소유도와 연관된 분자 및 단백질을 통한 신경세포, 교세포 및 호중구와 같은 염증세포의 활성화에 PLD신호전달 경로에 이르는 네트워크를 규명하고자 하였다. 본 연구에서는 APP가 PLD단백질과 어떻게 상호작용을 하고 있는지를 조사하였다. 뇌조직의 추출물을 PLD단백질에 특이적인 항체를 이용하여 면역침전하여 PLD의 발현을 조사한 결과 정상조직보다 치매환자의 뇌조직에서 증가하였고, PLD효소 활성도 증가였다. 또한, 세포 내 어느 부위에서 PLD 단백질의 양미 증가되었는지를 조사하기 위해, 분획화하여 실험한 결과, 정상조직보다 병변 뇌 조직에서 mitochondria 분획에 존재하는 PLD의 양이 증가하였다. amyloid precursor protein (APP)을 교세포에 transfection하여 과발현시켰을 때 PLD효소 활성이 대조군에 비하여 증가되었다. PLD유전자와 Myc-tagged APP유전자를 COS-7 세포에 transfection 시킨 후 면역침전을 통해 이들 두 단백질이 상호 결합함을 밝혔으며, APP는 PLD2의 N 말단 184에서 313부위의 아미노산을 함유하는 부위에서 결합하고 있었다. GST-pull down assay를 통하여, COS-7 세포에 transfection된 PLDI과 2는 APP의 β-amyloid 부위와 결합하였고, 쥐의 뇌의 추출물에서도 PLDI이 β-amyloid와 endogeneous하게 결합하고 있었다 교세포에서, PLD활성을 증가시키는 물질로서 녹차의 성분인 catechin임을 확인하였으며, 이중 EGCG가 가장 높은 PLD 효소활성을 보여주고 있었다. EGCG에 의한 PLD 활성을 증가시키는 기전을 조사한 결과 PLC, PKC, calciuuL ROS를 통해 일어남을 규명하였다.
Abstract▼
Alzheimer's disease(AD) is neuro-degenerative disease which affects aged people in high risk. AD is caused by loss of neuronal cell in brain. Amyloid beta protein (Aβ) is known to play an important role in the pathogenesis of AD. It has been shown that patients with chronic inflammatory lesion have
Alzheimer's disease(AD) is neuro-degenerative disease which affects aged people in high risk. AD is caused by loss of neuronal cell in brain. Amyloid beta protein (Aβ) is known to play an important role in the pathogenesis of AD. It has been shown that patients with chronic inflammatory lesion have higher incidence of AD than normal control and anti-nflammatory drugs has been shown to use for the disease. Phospholipase D(PLD) hydrolyzes phospholipid, mainly phosphatidylcholine into phosphatidic acid (PA) and choline. Recently, our group reported that overexpression of alzheimer precusor protein (APP) in mammalian cells caused the activation and expression of PLD, suggesting that signaling network through PLD may playa role in pathophysiological changes of brain in neurological diseases. Our specific aim in this study is to identify the role and network of PLD in the activation of neuronal, astrocytes, and inflammatory cells, such as neutrophils and to screen potent new peptides affecting the cell functions. Thus, we can provide important and novel scientific information and clues in treatment of neuro-degenerative diseases, including AD. Astrocyte is cells mediating inflammatory responses in brain. and activated astrocytes ill injured brain produce various inflammatory mediators. Recently, our group found that PLD protein levels were increased in brain of ischemic and dementia patients. Moreover, we found that the expression of cyclooxygenase-2 (COX -2) is essential for the increased expression of PLD. In 1st subject, the role and networking of PLD in reactive oxygen or its related molecules-induced activation of inflammatory cells were investigated. More specifically, the interaction between APP and PLD was studied. Immunoprecipitation assay using extracts of rat brain and anti-PLD antibody showed that PLD expression level in dementia patients was higher than control and PLD activity was also increased in the patients' extracts. PLD protein was mainly detected in mitochondrial fraction. Over-expression of amyloid precursor protein (APP) using transient transfection method caused the increase of .PLD activity in cells. We found that PLD protein and Myc-tagged APP proteins were co-immunoprecipitated after transient transfection of plasmid containing their specific cDNAs. APP interacted with fraction of N terminal 184-313 amino acid domain of PLD2. GST-pull down assay showed that overexpressed PLD1 and 2 interacted with β-amyloid fraction of APP in COS-7 cells and endogenous PLD1 interacted with β-amyloid ill the extracts of rat brain. In astrocytes, catechinfb of green tea increased PLD activity, and EGCG had highest potency in activating PLD. EGCG-induced PLD activation was identified through the pathways of PLC, PKC, calcium, and ROS. Moreover, we found that EGCG up-regulated COX-2 expression and PLD activation was mediated thorough the EGCG-induced expression of COX2.
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