초록 ▼

1. 특이항체 생성을 위한 항원의 탐색 및 제조
1) 항원의 탐색
여러 학술지를 검색하여 항체형성이 보고 된 peptide를 항원 후보로 선정하였으며, 한우에서는 전혀 발현되지 않는 단백질을 찾아내기 위해 소와 유전적인 상관성이 떨어지는 종을 계통 발생도를 참고해 검색하여 몇 가지 후보군을 확보하였다. 선별한 단백질의 아미노산 서열을 기초로 하여 항원성 부위 (epitope)를 검색하였으며, 그 후 AntheProt와 SciProtein 등과 같은 분석 프로그램으로 antigenic index, surface probab

1. 특이항체 생성을 위한 항원의 탐색 및 제조
1) 항원의 탐색
여러 학술지를 검색하여 항체형성이 보고 된 peptide를 항원 후보로 선정하였으며, 한우에서는 전혀 발현되지 않는 단백질을 찾아내기 위해 소와 유전적인 상관성이 떨어지는 종을 계통 발생도를 참고해 검색하여 몇 가지 후보군을 확보하였다. 선별한 단백질의 아미노산 서열을 기초로 하여 항원성 부위 (epitope)를 검색하였으며, 그 후 AntheProt와 SciProtein 등과 같은 분석 프로그램으로 antigenic index, surface probability, hydrophilicity, flexible region 등의 항목을 분석하였다
2) 항원 peptide 제조
한우 면역화 시험을 위해, 앞서 선정한 Protein A 및 Protein B의 sequence를 참고해 peptide 합성 전문 업체에 합성 의뢰하였다. 또한, 특정 항원에 대한 항체의 생성 및 검출을 목적으로 하는 본 연구에서 합성 의뢰한 모든 peptide들은 T-cell immune response가 일반적으로 자연계에 존재하는 L-form peptide보다 높은 것으로 보고 된 D-form으로 제작하여 사용하였다.
또한 peptide의 크기가 작기 때문에 면역반응이 약하거나 반응을 일으키지 않을 수 있으므로 면역반응을 유발 또는 촉진시키기 위하여 분자량이 큰 carrier protein을 부착시켜 주었는데, 면역주사를 위한 peptide에는 KLH (Keyhole Limpet Hemacyanin)를, ELISA test나 Western immunoblotting을 통한 항체 검출용 peptide에는 ovalbumin을 carrier protein으로 사용하였다.
3) 유전자 재조합 기술에 의한 항원의 대랑 생산
항원으로 선정한 peptide를 합성할 경우 막대한 경비 부담 문제가 있기 때문에 유전자 재조합 기술로 peptide을 대량 생산 할 수 있는 가능성을 검토해 보았다. 선정한 peptide에 대한 상보적인 forward nucleotide와 reverse nucleotide를 pET15b vector에 annealing시켜 cDNA 형태로 제조한 뒤 ligation을 실시하였다. Ligation 된 vector를 DH5α(competent cell)에 heat shock을 주어 transformation 시켰으며, LB Ampicillin agarose plate에서 배양 후 생성된 colony를 다시 LB liquid culture로 대량 증식 시켰으며, large scale plasmid preparation으로 DNA extraction을 실시하였다.
2. 특이 항체 생성 및 검출
1) 흰쥐(Sprague-Dawley rat)를 이용한 예비시험
한우 브랜드육 식별 기술 개발을 위한 본 연구의 접근방법에 있어서 가장 근본적인 조사항목인 육즙 내 항체 검출 가능성에 관한 검증은 실험용 흰쥐를 이용해 실시하였다.
Sprague-Dawley 흰쥐에 APM (Adipocyte Plasma Membrane)과 BSA (Bovine Serum Albumin)를 면역주사 하였다. 면역주사하기 전과 주사 후에 채혈을 하며 항체의 생성을 비교하였으며, 8주 후에는 시험동물을 모두 질식사시킨 후, 적출 가능한 모든 근육조직을 분리하였다. 분리된 근육조직에 saline을 첨가 후 Stomacher로 타격해 육즙을 생산하였다. 육즙 내 항체의 검출 가능성 및 육즙 내 항체의 검출 수준을 ELISA로 확인하였으며, APM 및 BSA를 전기영동 후 Western immunoblotting을 실시해 항원-항체의 결합 패턴을 확인하였다.

Abstract ▼

1. Screening and synthesis of antigens to produce specific antibodies
1) Screening of antigens
Candidate antigens reported to produce antibodies in various journals were screened based on "species involution tree" which may not have relationship with bovine genetically. Epitopic sites were che

1. Screening and synthesis of antigens to produce specific antibodies
1) Screening of antigens
Candidate antigens reported to produce antibodies in various journals were screened based on "species involution tree" which may not have relationship with bovine genetically. Epitopic sites were checked based on the amino acid sequences of selected proteins, and then analysed for antigenic index, surface probability, hydrophilicity, and flexible region using AntheProt and SciProein software.
2) Synthesis of antigenic peptides
The selected peptides, protein A and protein B, were synthesized in commercial company. All peptides synthesized in the current study was a D-form because D-form was reported to have higher T-cell immune response than natural L-form.
Carrier proteins were conjugated to small peptides to stimulate immune responses. KLH(Keyhole Limpet Hemacyanin) was used for immunization and ovalbumin was used for ELISA test and immunoblotting to detect antibodies.
3) Production of the antigens using recombinant DNA technology
The possibilities to produce antigens using recombinant DNA technology was examined in consideration of producing antigens in cheap price.
Forward and reverse nucleotides for the selected peptides were annealed into plasmid vector, pET 15b, and ligated. Ligated vectors were transformed in to DH5α competent cells by heat shock, and the colonies on ampicillin agarose plates were selected and cultured in LB liquid media for large scale plasmid preparation.
2. Antibody production and detection
1) Preliminary study using Sprague-Dawley rats
The essential part of the current study was to determine the possibilities of detection of any antibodies remaining in the muscle tissue of immunized animals and this was tested by preliminary study using Sprague-Dawley rats.
Sprague-Dawley rats were immunized with APM (adipocyte plasma membrane) and BSA (bovine serum albumin). Blood was taken from animals before and after immunization to test immune responses. And muscle tissue was collected from immunized animals after 8 weeks of immunization. ELISA test and Western immunoblotting were performed to test antibody in both serum and muscle tissue.

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과제의 개요...24
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...26
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...28
• 제 1 절 연구개발수행 내용...28
• 1. 특이 항체 생성을 위한 항원의 탐색 및 제조...28
• 1) 항원의 탐색...28
• 2) 항원 peptide 제조...29
• 3) 유전자 재조합 기술에 의한 항원의 대량생산...30
• ① 한우 특이 단백질 유전자의 확보...30
• ② 발현 vector의 구성 및 발현 조건 설정...31
• ③ 특이 단백질의 대량 확보...33
• 2. 특이 항체 생성 및 검출...36
• 1) 흰쥐 (Sprague-Dawley rat)를 이용한 예비 시험...36
• ① 시험 동물...36
• ② 항원의 준비와 면역 주사...36
• ③ 항혈청 및 육즙의 생산...37
• 2) 면양에서의 특이 항체 생성...39
• ① 시험 동물 및 면역화 과정...39
• ② 항혈청 및 육즙의 생산...40
• ③ Affinity column을 통한 항체의 정제...42
• ④ 최적의 항체 검출 조건 설정...42
• 3) 브랜드육 식별 기술 개발을 위한 한우 면역화 시험...43
• ① one-shot 처리구...43
• ② Boosting 처리구...45
• 3. 한우 브랜드육 식별 진단 rapid kit의 제조...46
• 1) 항체 생성을 위한 다양한 조건 탐색...46
• 2) ELISA 및 Dot-blot을 통한 항체 생성도 측정...46
• 3) Gold conjugate의 제조...48
• 4) Assay strip의 제조...48
• 5) Half test...48
• 6) Prototype kit의 준비...49
• 제 2 절 연구개발수행 결과...50
• 1. 항원의 선발 및 제작...50
• 1) 항원의 선발...50
• 2) 유전자 재조합 기술을 이용한 항원의 대량 생산...50
• 2. 특이 항체 생성 및 검출...53
• 1) 흰쥐 (Sprague-Dawley rat)을 이용한 예비 시험...53
• 2) 면양을 이용한 육즙 내 항체 생산 시험...57
• 3) 브랜드육 식별 기술 개발을 위한 한우 면역화 시험...66
• 3. 한우 브랜드육 식별 진단 rapid kit의 제조...73
• 1) 최적의 항체 형성을 위한 조건 탐색...73
• ① 항원 주사량이 항체 형성에 미치는 영향 조사...73
• ② Boosting이 항체 형성에 미치는 영향 조사...74
• ③ Alum 및 FCA와 같은 Adjuvant의 선택이 항체 형성에 미치는 영향...75
• 2) Rapid kit 제조...76
• ① Rapid kit의 strip 제조를 위한 조건 탐색...76
• ② Dot-blot을 이용한 조건 탐색...77
• ③ 육즙의 희석배율에 빠른 strip에서의 반응 변화...77
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...82
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...84
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...85
• 제 7 장 참고문헌...86