초록 ▼

본 과제는 프로테오믹스 기술에 기반한 골다공증 표적 및 표지 단백질을 발굴하기 위한 것으로 골흡수를 일으키는 세포인 파골세포의 분화 및 활성화에 따라 발현의 차별성을 보이는 단백질과 뼈를 만드는 세포인 조골세포의 세포자멸사를 조절에 관여하는 단백질과 골다공증의 병태-생리에 대한 이해를 증진시킬 수 있는 단백질의 동정 및 그 기능 연구를 목적으로 하였다.
프로테오믹스 기술로 2DE에 기반한 단백질 발현레벨 분석법과 MALDI-TOF 및 ESI-Q/TOF에 기반한 mass 분석기술이 활용되었다. 파골세포의 whole cell ly

본 과제는 프로테오믹스 기술에 기반한 골다공증 표적 및 표지 단백질을 발굴하기 위한 것으로 골흡수를 일으키는 세포인 파골세포의 분화 및 활성화에 따라 발현의 차별성을 보이는 단백질과 뼈를 만드는 세포인 조골세포의 세포자멸사를 조절에 관여하는 단백질과 골다공증의 병태-생리에 대한 이해를 증진시킬 수 있는 단백질의 동정 및 그 기능 연구를 목적으로 하였다.
프로테오믹스 기술로 2DE에 기반한 단백질 발현레벨 분석법과 MALDI-TOF 및 ESI-Q/TOF에 기반한 mass 분석기술이 활용되었다. 파골세포의 whole cell lysate에서 세포의 분화에 따라 증감하는 단백체, 파골세포의 활성화에 따라 변화하는 래프트 단백체, 분비단백체, 핵내 단백체를 분석하였으며 파골세포의 활성에 핵심적인 역할을 하는 TRAF6와 결합하는 단백체를 affinity column을 응용하여 분리 동정 하였다.
TRAF6 결합 단백질의 동정과 동정된 단백질의 파골세포 활성과 관련한 기능에 대한 연구를 수행하였고 파골세포에서의 래프트의 중요성을 밝혔다.
ESI-Q/TOF로 분석하여 파골세포 분화 후 증가하는 단백질로 밝힌 CK-B의 기능에 대한 심층 연구를 siRNA 등을 활용하여 in vitro상에서 수행하여 파골세포의 분화 및 기능에 CK-B가 매우 중요함을 밝혔으며 4 종류의 동물모델에서의 CK inhibitor의 골흡수 억제 효과를 분석 하였다.
또한, 2차성 골다공증의 원인인 Dexamethasone을 투여한 후 조골계열 세포를 배양하여 세포 및 배지에서 발현의 차이를 보이는 단백질을 동정하였으며, TNF-$\alpha$가 조골세포의 세포자멸사를 유도하고 TNF-$\alpha$가 산화스트레스를 증가시켜 NFκB와 JNK를 활성화시키는 새로운 세포신호전달기전을 관찰하였다. 항산화제인 $\alpha$-lipoic acid에 의한 조골세포의 세포자멸사 억제효과를 규명하였으며, $\alpha$-lipoic acid가 파골 전구세포에 직접 작용하여 파골세포의 형성을 억제하는 것을 관찰하였다. 이는 $\alpha$-lipoic acid가 골형성은 촉진하고 골흡수는 억제하는 이상적인 골다공증 치료제로 활용가능할 것임을 시사하는 소견이다.
난소-절제 Sprague-Dawlet rats을 이용하여 난소-절제후 뼈에서 차등 발현되는 단백을 분석하여 난소-절제후 유의하게 증가하는 “단백 A"를 동정하였다. “단백 A"는 동물 및 사람에서 모두 폐경 후 유의하게 혈중 농도가 증가하였으며, 폐경 후 증가하는 내인성 싸이토카인인 TNF-$\alpha$, IL-6, IL-1에 의해 ”단백 A"의 조골계열 세포 내 발현이 증가하였다. 마지막으로 “단백 A"는 파골세포의 형성을 촉진하고 골흡수를 관장함을 세포 수준에서 확인하여 그 주 기전이 파골세포에 직접 작용하여 골흡수를 증가시키는 것임을 시사하였다.

Abstract ▼

This study was to discover new therapeutic and diagnostic target proteins for osteoporosis by proteomics approaches. Proteins differentially expressed during osteoclast differentiation and activation and osteoblast apoptosis were pursued to be identified. The functional stufy of identified proteins

This study was to discover new therapeutic and diagnostic target proteins for osteoporosis by proteomics approaches. Proteins differentially expressed during osteoclast differentiation and activation and osteoblast apoptosis were pursued to be identified. The functional stufy of identified proteins was also included.
2DE-based protein sorting and image analyses and mass spectrometry of MALDI-TOF and ESI-Q/TOF were performed. whole cell lysates from osteoclasts before and after differentiation, rafts proteome from osteoclasts before and after activation, proteins secreted from osteoclasts, nuclear proteome of osteoclasts were analysed. The functional importance of rafts for osteoclast activity was investigated to rationalize rafts proteome anslyses.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...2
• 초록 ...3
• 요약문 ...4
• SUMMARY ...6
• CONTENTS ...7
• 목차 ...8
• 제1장 연구개발과제의 개요 ...9
• 제1절 연구개발의 목적 ...9
• 1. 최종목적 ...9
• 2. 단계 및 연차별 연구개발 목표 ...9
• 제2절 연구개발의 필요성 ...10
• 1. 기술적 측면 ...10
• 2. 경제·산업적 측면 ...11
• 3. 사회·문화적 측면 ...11
• 제3절 연구개발의 범위 ...13
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ...15
• 제1절 국외 연구개발 현황 및 능력 ...15
• 제2절 국내 연구개발 현황 및 능력 ...16
• 제3절 연구결과와 국내·외 기술개발현황 ...18
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...19
• 제1절 연구수행방법(이론적·실험적 접근방법) ...19
• 제2절 연구결과 ...23
• 1. 파골세포 프로테옴 분리 조건 및 2DE 패턴 확립...23
• 2. 파골세포에서의 래프트의 존재여부 및 중요성 규명...25
• 3. 파골세포에서의 래프트 프로테옴 분석...35
• 4. 파골세포에서의 핵내 단백질 동정 프로테옴 분석...38
• 5. TRAF6 결합 단백질 규명 및 그 기능 연구...40
• 6. 파골세포의 분화시 증가하는 단백질 CK-B의 발굴 및 그 기능에 관한 연구...47
• 7. 조골세포의 분화 조절 전사인자 결합 단백질의 발굴 및 그 기능에 관한 연구...57
• 8. Dexamethasone에 의한 조골계열 세포의 세포자멸사 관련 단백질 분석...63
• 9. α-Lipoic acid 처치 전후 차등 발현되는 단백 분석...67
• 10. 폐경 골다공증 동물 모델의 뼈에서 차등 발현되는 단백 연구...72
• 11. 임상 검증을 위한 검체 은행 구축...76
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...77
• 제1절 연구개발목표 달성도 ...77
• 제2절 관련분야에의 기여도 ...80
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ...82
• 제1절 추가연구의 필요성 ...82
• 제2절 향후 실용화 및 활용계획 ...82
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...84
• 제7장 참고문헌 ...85