초록 ▼

생명공학기법을 이용한 고품질 감귤품종 개발을 위하여 본 연구는 1세부과제(감귤 형질전환기법 개발), 2 협동과제(제1 협동과제: 당 및 기능성 대사관련 유전자를 클로닝, 제 2 협동과제: 감귤과실 특이발현 프로모터를 개발)로 구성하여 연구를 수행하였다.
제 1 세부과제에서는 크게 감귤류의 재분화 체계 확립과 주요 품종의 형질전환 기술 개발, 당 및 기능성 대사관련 유전자를 이용한 주요 품종의 형질전환을 수행하였다. 이를 위해서 다음과 같은 과정을 통하여 연구를 수행하였다.
감귤속은 품종에 따라 식물체 재분화능이 현저하게

생명공학기법을 이용한 고품질 감귤품종 개발을 위하여 본 연구는 1세부과제(감귤 형질전환기법 개발), 2 협동과제(제1 협동과제: 당 및 기능성 대사관련 유전자를 클로닝, 제 2 협동과제: 감귤과실 특이발현 프로모터를 개발)로 구성하여 연구를 수행하였다.
제 1 세부과제에서는 크게 감귤류의 재분화 체계 확립과 주요 품종의 형질전환 기술 개발, 당 및 기능성 대사관련 유전자를 이용한 주요 품종의 형질전환을 수행하였다. 이를 위해서 다음과 같은 과정을 통하여 연구를 수행하였다.
감귤속은 품종에 따라 식물체 재분화능이 현저하게 차이가 나므로 현재 기내 재분화 체계가 확립되어 있는 오렌지를 대조로 하여 주요 품종별로 미숙조직을 배양하여 embryogenic callus를 유기, 증식하고 그 캘러스를 사용하여 식물체 재분화 체계를 확립한다.
배발생 Callus를 균일하게 증식하기 위해서 생장조절 물질 및 기타조건을 검토한다.
식물체 재분화 체계를 바탕으로 외래유전자의 도입을 위한 품종별 형질전환 효율을 극대화할 수 있는 적절한 조건과 형질전환방법(Agrobacterium법)을 구명한다.
형질전환체의 기내1차 선발 기준을 확립함으로써 본 연구의 효율화를 도모한다.
Agrobacterium법을 이용한 형질전환 시 영향을 미치는 Agrobacterium strain, inoculation 시간 및 온도, Acetosyringone의 첨가농도, 선발배지 조성 등에 대하여 실험한다.
개선된 형질전환 체계를 바탕으로 기존에 클로닝 되어 있는 당합성 관련 유전자와 기능성 성분 합성 관련 유전자를 이용하여 형질전환을 시작한다.
감귤의 당합성과 기능성 성분의 합성에 관여하는 유전자의 클로닝과 조직특이 발현 프로모터를 개발하여 재조합된 유전자를 감귤 세포에 도입하여 형질전환 된 식물체를 육성한다.
제1협동과제에서는 당대사 및 카로티노이드 대사 관련 유전자의 클로닝을 수행하였다. 유전자클로닝을 위하여 감귤의 잎과 과육으로 cDNA library 제작한 후 RT-PCR과 subcloning을 통하여 관련 유전자를 분리하고 제어 유전자 선발 및 유전자 발현 제어 벡터를 제작하였다.
제2협동과제에서는 감귤 과실특이발현 프로모터 개발을 위하여 다음과 같은 단계로 연구를 수행하였다.
proteomics 연구: 2-D 전기영동을 포함한 proteomics 연구를 통하여 과실과 잎 특이 발현 유전자를 찾아내고 이를 도구로 사용하여 프로모터를 탐색한다.
cDNA library differential screening을 통하여 과실 특이 클론을 확보한다.
확보한 과실과 잎 특이 프로모터를 분석한다.
GUS 유전자를 이용한 형질전환용 벡터제작
제작된 형질전환용 벡터를 이용하여 애기장대와 담배의 형질전환체를 육성한다.
육성된 형질전환 식물체를 이용하여 프로모터 활성도를 분석한다.

Abstract ▼

In the last century, efforts through traditional plant breeding techniques have increased many agronomic aspects and nutritional values of food plant including fruit trees. The main drawback of traditional plant breeding is that it relies on the use of germplasm of the same or closely related specie

In the last century, efforts through traditional plant breeding techniques have increased many agronomic aspects and nutritional values of food plant including fruit trees. The main drawback of traditional plant breeding is that it relies on the use of germplasm of the same or closely related species, which is sometimes a serious limiting factor. In addition, progress is time-consuming and relies on the extensive use of natural resources. Plant molecular breeding method, especially transgenic plant production, is an alternative option for plant improvement.
Transgenic plant production is a powerful technique for introducing new traits into plants. Its major advantage, rather than conventional cross-breeding, is that a specific advantageous trait could be added to a given cultivar or rootstock genome without avoiding burdens of sexual recombination and involvement of deleterious characteristics.
The process of transgenic plant production consists of an alien DNA introduction into plant cells, transformant screening, plant regeneration from transformed callus. The establishment of tissue culture system including callus induction, somatic embryogenesis or organogenesis, plant regeneration is prerequisite for successful transformation.
Transformation of woody plants is still quite rate. In particulra, citrus is known to be recalcitrant species which are difficult to regenerate plants by cell or tissue culture. Citrus unshiu, the most important crop in Jeju, is especially recalcitrant among citrus species.
The goals of this study are 1) to develope regeneration transformation system for citrus species, 2) to produce a transgenic citrus plant, 3) to isolate genes which control pathways of carbohydrate and carotenoid biosynthesis, and 4) to find fruit specific promoters.

목차 Contents

• 제 1 장 서론 ... 22
• 제 1 절 연구개발의 배경 ... 22
• 제 2 절 연구개발의 내용 및 범위 ... 24
• 제 2 장 감귤 형질전환 기법 개발 ... 27
• 제 1 절 서언 ... 27
• 제 2 절 연구개발 방법 ... 28
• 1. 감귤 주요 품종의 embryogenic callus 유기 ... 28
• 2. 캘러스 전처리에 의한 온주밀감 식물체 재분화율 향상 ... 28
• 3. Agrobacterium법을 이용한 형질전환 기술 개선 ... 29
• 가. Agrobacterium strain ... 29
• 나. 접종시간 ... 29
• 다. Acetosyringon(AS) 첨가 농도 ... 29
• 라. callus 상처처리 ... 30
• 마. Callus 크기 ... 30
• 4. 카로티노이드 및 당 생합성관련 유전자의 도입 ... 30
• 5. 기내 재분화식물체 순화 및 온실 육묘 ... 32
• 6. 형질전환후보개체 PCR analysis ... 32
• 제 3 절 감귤 regeneration 체계 확립 ... 33
• 1. 감귤 germplasm별 plant regeneration 체계 확립 ... 33
• 2. 캘러스 전처리에 의한 온주밀감의 식물체 재분화율 향상 ... 36
• 제 4 절 감귤 형질전환 체계 확립 ... 38
• 1. GUS 유전자를 이용한 감귤 형질전환 ... 38
• 2. Agrobacterium법 형질전환 기술 개선 ... 40
• 가. Agrobacterium strain ... 40
• 나. 접종시간 ... 41
• 다. Acetosyringon(AS) 첨가 농도 ... 42
• 라. callus 상처처리 ... 43
• 마. callus 크기 ... 43
• 제 5 절 당 및 카로티노이드 생합성 관련 유전자 형질전환 ... 44
• 1. 카로티노이드 생합성 관련 유전자 형질전환 ... 44
• 2. 당 생합성 관련 유전자의 형질전환 ... 45
• 3. 재분화 신초의 순화 및 육묘 ... 46
• 4. 형질전환 후보개체 PCR analysis ... 47
• 제 3 장 감귤 당 및 기능성 물질 대사관련 유전자클로닝 ... 50
• 제 1 절 서언 ... 50
• 제 2 절 연구개발방법 ... 51
• 1. RNA 추출 및 mRNA 분리 ... 51
• 2. 감귤 cDNA library 제작 ... 52
• 3. Probe 제작 ... 53
• 4. 유전자(cDNA)의 분리 및 염기서열 결정 ... 53
• 5. 감귤형질전환용 벡터의 제작 ... 53
• 제 3 절 카로티노이드 생합성 유전자의 분리 ... 54
• 제 4 절 당 합성 및 수송 관련 유전자의 분리 ... 59
• 제 5 절 감귤 형질전환용 벡터의 제작 ... 64
• 제 4 장 감귤 과실특이 발현 프로모터 개발 ... 69
• 제 1 절 서언 ... 69
• 제 2 절 Proteomics 연구 ... 69
• 제 3 절 cDNA subtraction에 의한 과실 특이 유전자 클로닝 ... 71
• 제 4 절 Northern blot 분석 ... 74
• 제 5 절 Genomic library screening ... 76
• 1. Plating, titering, plaque lifting ... 76
• 2. Hybridization ... 77
• 3. In vivo excision ... 77
• 4. Genomic clone의 염기서열 분석과 프로모터 분석 ... 79
• 제 6 절 Citrus TOM의 클로닝 ... 82
• 제 7 절 Arabidopsis 형질전환 시스템 구축 및 유전자의 도입 ... 87
• 1. 형질전환 시스템 구축 ... 87
• 2. 프로모터의 클로닝과 형질전환 ... 88
• 제 8 절 토마토 형질전환 시스템 구축 ... 90
• 제 5 장 참고문헌 ... 92