자생식물이용기술개발사업;자생식물유래 성인형 당뇨 및 비만의 예방과 치료 식품의약소재 개발 Development of Neutraceuticals for Prevention and Curing of Type II Diabetes and Obesity from Domestic Plants원문보기
보고서 정보
주관연구기관
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
자생식물로부터 당뇨 및 비만 치료의 약물 개발 타겟이 되고 있는 protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) 및 지방산생합성효소 (fatty acid synthase, FAS) 저해물질을 탐색하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 인체유래 PTP1B 유전자를 대장균에서 발현시켜 효소원으로 확보하고 PTP1B 저해활성 검색계를 96 well plate로 수립하였다. 또한, SD rat의 간으로부터 FAS에 대한 검색계를 확립하고 PTP1B 및 FAS 검색계를 대상으로 생약 및 자생식물 추출물 1,200 종에
자생식물로부터 당뇨 및 비만 치료의 약물 개발 타겟이 되고 있는 protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) 및 지방산생합성효소 (fatty acid synthase, FAS) 저해물질을 탐색하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 인체유래 PTP1B 유전자를 대장균에서 발현시켜 효소원으로 확보하고 PTP1B 저해활성 검색계를 96 well plate로 수립하였다. 또한, SD rat의 간으로부터 FAS에 대한 검색계를 확립하고 PTP1B 및 FAS 검색계를 대상으로 생약 및 자생식물 추출물 1,200 종에 대한 활성 검색으로부터 단삼, 상백피, 보골지, 희첨, 비자, 검노린재, 석곡, 숙은노루오줌, 관중, 권백 등 10여종의 후보식물을 선정하였다. 단삼으로부터 3종의 abietan 계 diterpenes가 활성성분으로 분리되었고, 상백피에서는 ssangenone G등 6가지의 화합물이 PTP1B 저해 성분으로 분리되었다. 보골지에서는 3종의 coumestan계 물질이 활성성분으로 분리되었다. 비자에서는 damarane 계 triterpenoid인 semialacton과 그 유도체 2종이 신규물질로 분리되었다. 희첨에서 6종의 신규 지방산 에스테르 화합물이 분리되었고 PTP1B에 대하여 상대적으로 강한 저해활성을 보여주었다. 검노린재에서는 3종의 urasne 계 triterpenes가 활성성분으로 분리되었다. 분리된 PTP1B 저해 물질에 대하여 여러 가지 다른 protein tyrosine phosphatases에 대한 선택적인 활성을 조사하였다. 또한, 이들 활성물질이 세포내에서 PTP1B를 저해하는 지 확인하기 위해 인슐린 수용체(IR)의 타이로신 인산화의 정도를 분석 확인하였다. 아울러 상백피에서 분리된 sanggenon G와 희첨, 구아바, 필발에서 확인된 활성분획을 포함한 분획에 관하여 당뇨병 모델 마우스(db/db or ob/ob)에서 in-vivo 혈당강하 효과를 측정하였다. 또한, 권백으로부터 분리된 3종의 biflavonoids 및 관중에서 분리된 10종의 acylphloroglucinol 유도체들이 새로운 형태의 지방산생합성효소 저해물질로 확인되었다.
Abstract▼
1. Establishment of PTPase assay and inhibitor screening system (PTP1B) For the screening of inhibitors for PTP1B, the enzymes were obtained from the E. coli expressed by the cDNA of human PTP1B his-tagged. Using pNPP as substrate of PTPase, the detection method of the enzyme activity is establis
1. Establishment of PTPase assay and inhibitor screening system (PTP1B) For the screening of inhibitors for PTP1B, the enzymes were obtained from the E. coli expressed by the cDNA of human PTP1B his-tagged. Using pNPP as substrate of PTPase, the detection method of the enzyme activity is established and the miniature system for 96 microwell plate was also constructed. 2. Establishment of FAS assay and inhibitor screening system (FAS) FAS was purified from SD rat liver by using stepwise ammonium sulfate precipitation, gel filtration and anion exchange chromatography. FAS was 95% pure as estimated from SDS/PAGE with Coomassie blue staining. FAS activity was measured by analysis of the incorporation of $[^3H]$-acetyl CoA into palmitate. 3. Screening of medicinal plants for inhibitors For the primary screening of inhibitors from plant resources, the solvent extracts of domestic plants and oriental medicine have been prepared. The extracts were assayed for the inhibitory activity against PTP1B and FAS enzymes and candidate plants selected. 4. Isolation and chemical structure determination of inhibitory compounds 4-1. Isolation of inhibitory compounds from domestic plants From the selected candidate of plant source, the inhibitory compounds could be isolated as a pure compound after extraction with series of solvents including MeOH, acetone, and by the aids of column, affinity chromatography, HPLC, and other techniques for isolating compounds 4-2. Chemical structure of isolated compounds The chemical structures of isolated inhibitors could be determined using NMR, Mass, IR and etc. 5. Analysis of the activities of the isolated compounds against PTP1B and FAS The inhibitory activities of isolated compounds against various protein phosphatases such as DSPase, PTPase and PPase, and FAS could be evaluated and were compared. 6. Analysis of the isolated compounds on intracellular protein phosphorylations Since PTP1B is located downstream of insulin receptor (IR) negatively regulating the tyrosine phosphorylation of IR and glucose uptake, the inhibitory compounds against PTP1B would be tested for their ability to increase the basic level of IR tyrosine phosphorylation in $32D^{IR}$ cells. 7. The activity evaluation of isolated compounds or active fractions against anti-diabetes and anti-obesity The anti-diabetes and anti-obesity activities of isolated compounds could be evaluated through in vivo analysis for blood glucose and body weight using db/db mouse or ob/ob mouse as animal models by treatment of oral administration or intraperitoneal injection.
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