초록 ▼

본 연구는 단향을 포함한 자생식물 추출물에서 복제단백질 MCM의 발현을 조절하는 물질을 분리하여 항암 활성을 규명하고 항암식품의약으로 개발하는 것으로 다음과 같은 연구 내용과 결과를 얻었다.
$\bigcirc$ 자단향에서 항암물질 추출
- 추출물의 암세포에 대한 항암활성(세포독성, 암세포 증식억제 효과, 미토콘드리아 의존형 세포사 유도, 세포주기 Gl기 정지 효과) 규명
- mouse를 이용한 in vivo 암 조직 감소 효과 확인
$\bigcirc$ 향나무에서 MCM 단

본 연구는 단향을 포함한 자생식물 추출물에서 복제단백질 MCM의 발현을 조절하는 물질을 분리하여 항암 활성을 규명하고 항암식품의약으로 개발하는 것으로 다음과 같은 연구 내용과 결과를 얻었다.
$\bigcirc$ 자단향에서 항암물질 추출
- 추출물의 암세포에 대한 항암활성(세포독성, 암세포 증식억제 효과, 미토콘드리아 의존형 세포사 유도, 세포주기 Gl기 정지 효과) 규명
- mouse를 이용한 in vivo 암 조직 감소 효과 확인
$\bigcirc$ 향나무에서 MCM 단백질 발현 억제 물질의 분리와 항암활성
- 추출물의 in vitro 항암활성(내용 상동) 규명
- MCM 발현 억제 유효성분 cedrol 분리, 구조 규명 및 항암활성 규명
$\bigcirc$ 자귀나무 추출물의 백혈병 Jurkat T 세포에 대한 항암활성
- 세포사 유도 물질인 HaBC18의 분리 정제 및 항암활성 규명
$\bigcirc$ 백단향에서 MCM 발현 억제물질 분리
- MCM 발현 억제 유효 성분 isoschaftoside 분리 및 구조 규명
$\bigcirc$ MCM promoter에서 E-box와 E2F 결합부위의 전사활성에 대한 역할 규명

Abstract ▼

To develop new anticancer agents, we isolated MCM protein reducing compound from medicinal plants including Juniperus chinensis and identified their chemical structure. Extracts of medicinal plants or active compounds isolated were tested their biological activity by molecular biological methods.

To develop new anticancer agents, we isolated MCM protein reducing compound from medicinal plants including Juniperus chinensis and identified their chemical structure. Extracts of medicinal plants or active compounds isolated were tested their biological activity by molecular biological methods.
The possibilities for development anticancer neutraceutics or drugs were also investigated through out experiment of in vivo anticancer activity and safety using mouse.
To examine antitumoric mechanism of MCM proteins reducing compound, microarray analyses using cancer DNA chip were carried out and investigation of the correlation with other anticancer signal pathways including Induction pathway of apoptosis and cell cycle arrest were followed.

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 24
• 제 1 절 연구개 발의 목적 ... 24
• 제 2 절 연구개발의 필요성 및 중요성 ... 24
• 1. 연구개발의 과학기술 및 사회경제적 중요성 ... 24
• 2. 연구개발의 기술적 필요성 ... 25
• 3. 연구개 발의 범위 ... 25
• 가. 자생식물로부터 MCM 발현조절 물질의 분리 및 구조 규명 ... 25
• 나. 항암 생리 활성 검색 ... 25
• 다. 암세포 증식 억제 기작 규명 ... 26
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 27
• 제 1 절 국내$\cdot$외 관련분야에 대한 기술개발현황 ... 27
• 1. MCM 복제 단백질 관련 분야에 대한 기술개발 현황 ... 27
• 2. 세포주기 조절에 의한 세포사 관련 단백질의 기술 개발 현황 ... 28
• 3. 본 연구결과가 국내$\cdot$외 기술개발현황에서 차지하는 위치 ... 29
• 제 3 장 연구 개발 수행 내용 및 결과 ... 31
• 제 1 절 자단향으로 부터 항암물질 추출 ... 31
• 1. 서론 ... 31
• 2. 재료 및 방법 ... 33
• 가. 재료 ... 33
• 나. 자단향 추출물 제조 ... 34
• 다. 세포독성 효과 측정 ... 34
• 라. 세포 증식 억제 효과 측정 ... 35
• 마. 자가소멸소체(apoptotic body) 생성 화인 ... 35
• 바. apoptosis 관련 유전자의 발현 검토 ... 36
• 사. 세포주기 변화측정(Flow cytometry) ... 36
• 아. DNA chip 분석 ... 36
• 자. 시료의 독성실험 ... 38
• 차. mouse 모델에서의 복강암 세포주 억제효과 시험 ... 38
• 3. 결과 및 고찰 ... 38
• 가. 암세포에 대한 자단향 조추출물의 세포독성 측정 ... 38
• 나. HeLa 세포에 대한 자단향 조추출물의 세포 증식 억제 측정 ... 42
• 다. 자단향 조추출물을 처리한 HeLa 세포의 세포주기 변화 ... 42
• 라. 자단향 추출물을 처리한 HeLa 세포의 자가소멸 소체 확인 ... 43
• 마. 자단향 추출물을 처리한 HeLa 세포의 세포사 경로의 활성화 ... 43
• 바. 자단향 추출물을 처리한 HeLa 세포의 DNA chip 분석 ... 46
• 사. 자단향 추출물의 독성 실험 ... 47
• 아. 자단향 추출물에 의한 in vivo 항암활성 ... 50
• 제 2 절 향나무에서 MCM 단백질 발현 억제 물질의 분리와 항암활성 ... 51
• 1. 서론 ... 51
• 2. 재료 및 방법 ... 52
• 가. 재료 ... 52
• 나. 향나무 추출 방법 및 유효 성분의 분리 및 구조 규명 ... 52
• 다. 기타의 방법 ... 52
• 라. MCM 단백질의 발현 저하 확인 ... 53
• 3. 결과 및 고찰 ... 53
• 가. 향나무 추출 및 분리 정제 ... 53
• 나. 암세포에 대한 Cedrol의 세포독성 측정 ... 53
• 다. HT29 세포에 대한 Cedrol의 세포 증식 억제 측정 ... 60
• 라. Cedrol를 처리한 HT29 세포의 세포주기 변화 ... 60
• 마. Cedrol를 처리한 HT29 세포의 apoptosis pathway의 활성화 ... 62
• 바. Cedrol를 처리한 HT29 세포의 MCM 단백질의 발현 저하 확인 ... 62
• 제 3 절 자귀나무 추출물의 인체 급성 백혈병 jurkat T 세포에 대한 항암활성 ... 64
• 1. 서론 ... 64
• 2. 재료 및 방법 ... 65
• 가. 자귀나무 추출 및 분리 정제 ... 65
• 나. 시약, 항체 및 세포배양 ... 68
• 다. 세포독성 시험 ... 68
• 라. DAPI 염색법 ... 68
• 마. TUNEL 염색법 ... 69
• 바. DNA 단편화 ... 69
• 사. 단백질 추출 및 Western blot analysis ... 70
• 아. 세포질로 방출된 cytochrome c 추출 ... 70
• 자. 세포주기분석법 ... 70
• 3. 결과 ... 71
• 가. 자귀나무에서 분리한 유효성분의 순도측정 및 특성 ... 71
• 나. jurkat T 세포에 대한 HaBC18의 세포독성 ... 71
• 다. HaBC18 처리 jurkat T 세포의 DAPI 염색 ... 71
• 라. HaBC18 처리 jurkat T 세포의 TUNEL 염색 ... 74
• 마. HaBC18 처리 jurkat T 세포의 DNA fragmentation ... 75
• 바. HaBC18 처리 jurkat T 세포의 apoptosis Pathway ... 76
• 사. HaBC18 처리에 따른 jurkat T 세포의 세포주기 변화 ... 77
• 아. 정상세포 PBMC에 대한 HaBC18의 세포독성 ... 79
• 자. 각종 암세포에 대한 HaBC18의 세포독성 ... 80
• 4. 고찰 ... 81
• 제 4 절 백단향(Santalum album)으로 부터 MCM발현 억제물질의 분리 ... 83
• 1. 서론 ... 83
• 2. 재료 및 방법 ... 87
• 가. 재료 ... 87
• 나. 활성성분의 반응조건과 세포 파쇄 ... 87
• 다. Western blotting ... 88
• 라. RT-PCR ... 88
• 마. 백단향 추출물에서 유효성분의 추출 ... 89
• 바. 사용기기 ... 89
• 3. 연구 결과 ... 90
• 가. 유기용매 분획별 MCM 단백질의 발현량에 미치는 영향 ... 90
• 나. n-BuOH 분획으로 부터 유효 성분의 분리 ... 93
• 다. n-BuOH 분획에서 분리한 활성 물질의 구조 분석 ... 95
• 라. 유사 구조 물질과의 활성 비교 ... 103
• 제 5 절 MCM promoter에서 E-box와 E2F 결합부위가 전사활성에 미치는 영향 ... 105
• 1. 서론 ... 105
• 2. 재료 및 방법 ... 106
• 가. 세포주와 배양배지 ... 106
• 나. PCR을 이용한 hG3PDH 유전자 promoter의 cloning ... 107
• 다. MCM7 promoter E2F 결합부위 및 E-box 변이체 제작 ... 107
• 라. Human MCM2 유전자 promoter영역의 cloning ... 107
• 마. DNA sequencing ... 108
• 바. Luciferase Reporter Assay ... 108
• 3. 결과 ... 111
• 가. 정상세포와 암세포에서 MCM7 promoter 활성 비교 ... 111
• 나. MCM7 promoter 활성에 대한 E-box와 E2F 결합부위의 역할 ... 113
• 다. MCM2 promoter활성에 대한 E-box와 E2F 결합부위의 역할 ... 116
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 118
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 120
• 제 1 절 추가연구의 필요성 ... 120
• 제 2 절 MCM 발현 제어물질인 WR, CR의 제품화에 따른 연구 개발 필요성 ... 120
• 제 3 절 연구개발결과의 타 연구에의 응용 ... 121
• 제 4 절 기업화 추진 방안 ... 121
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 122
• 제 1 절 세포주기를 target으로 한 암 치료제 ... 122
• 1. RB/E2F 경로를 표적으로 한 항암제 ... 122
• 2. p53 경로를 표적으로 한 항암제 ... 123
• 제 7 장 참고문헌 ... 125