초록 ▼

S. chungbukensis DJ77의 서열 확보를 위해 fosmid library 제작 및 fosmid clone subcloning(EPS 클론인 FA494, 606, 421, 372 .338 등을 얻을수 있었음)과 shot gun library 제작하였으며, colony hybridization을 통한 EPS 생합성 관련 유전자 확보. S. chungbukensis DJ77의 유전체 data의 획득 및 분석을 동하여 EPS 유전자 목록을 데이터베이스화함. S. elodea ATCC 31461의 EPS cluster 들과 비교

S. chungbukensis DJ77의 서열 확보를 위해 fosmid library 제작 및 fosmid clone subcloning(EPS 클론인 FA494, 606, 421, 372 .338 등을 얻을수 있었음)과 shot gun library 제작하였으며, colony hybridization을 통한 EPS 생합성 관련 유전자 확보. S. chungbukensis DJ77의 유전체 data의 획득 및 분석을 동하여 EPS 유전자 목록을 데이터베이스화함. S. elodea ATCC 31461의 EPS cluster 들과 비교하여 S. chungbukensis DJ77 EPS cluster 유전자들을 확보. 다른 Sphingomonas 속 미생물들의 EPS 합성관련 효소 유전자에 관한 정보 수집 비교 유전체 분석을 통해 14종의 관련 유전자 197개의 유전자 정보를 DB로 구축. 기존에 밝혀진 gellan, xanthan, succinoglycan등의 EPS 생합성 대사회포를 구축하여 이를 바탕으로 DJ77의 EPS 생합성 대사회로를 예측함. EPS 유전자 중 priming 유전자로 작용하는 spsB, pmmC, spsA 유전자 발굴. Levan 생합성 관련에 작용하는 levansucrase 유전자의 발굴 및 활성 측정 EPS 생산 개량 균주를 제작하기 위한 homologous overexpression 시스템 구축하고 유전자 선정(spsB, spsA, gelA, gelN, gelM-EPS 합성 조절 유전자 및 export 관여 유전자 , priming 유전자) 하여 돌연변이체 획득. 돌연변이의 phrenotype 및 단백체의 변화를 알아보기 위해 SEM/TEM 및 2-DE를 시도하여 그 변화를 알아보고, EPS 생산량 및 viscosity 측정 등을 시도할 것임. S. chungbukenesis DJ77의 EPS 합성에 관여하는 효소들 중 phosphoglucomutase I(PGM), phosphomannomutase II(PMM) UDP-glucose pyrophsphorylase(UGP), UDP-glucose dehydrogenase(UGD), phosphoglucose isomerase(PGI), phosphomannose isomerase(PMI)를 target으로 하여 연구하였다. 각 유전자를 발현 vector에 cloning한 후 단백질을 순순 정제하여 효소특성연구를 수행. 각 효소마다 Vmax, Km, Kc 값과 pH에 관한 활성 연구, Native-PAGE를 수행하여 Native 상태의 PGM과 PMM의 분자량을 조사. Modeling을 통해 3차 구조를 추론하였고, 활성자해를 알아낸 후 그 중 활성에 중요한 역할을 할 것으로 추론되는 잔기를 가지고 site-directed mutagenesis를 수행. 균주의 보존과 EPS 생산은 각각 YPG 배지와 생산배지에서 48시간 배양하여 boiling method로 EPS를 회수하고 투석으로 정제하였음 S. chungbukensis DJ77과 S. eldoea ATCC 31461은 각각 sucrose, soluble starch를 탄소원으로 하였을때, glucose는 0.2%와 2%일때, 각각 트레오닌과 글푸타민산을 첨가해주었을 때 EPS 생산량이 가장 높았음. S. chungbukensis DJ77이 생산한 EPS-CB는 포도당, 만노오스를 가진 올리고당으로 포도당 -(1$\rightarrow$),$\rightarrow$3)-만노오스-(1$\rightarrow$,3$\rightarrow$) 포도당-(1$\rightarrow$ 으로 연결되어 있었고, S. eldoea ATCC 31461은 gellan을 생산하였음. Gellan은 전분입자의 팽윤과 호화액의 점도를 증가시켰고 전분겔의 구조를 개선시켜 탄성을 유지하고 냉동-해동 안정성을 증가시켰음. EPS-CB는 전분 호화액의 피크타임을 감소시키고 겔의 노화 억제효과가 있S level을 증가시켰음. Gellan은 증점제, 코팅제, capsule, 필름 제조로, EPS-CB는 노화억제제로 이용될 수 있으므로 식품산업 뿐만아니라 의약품 등 여러분야에 응용 가능함.

Abstract ▼

During the last decades, several extracellular polysaccharide (EPS)-producing microorganisms have gained increasing interesting, both for fundamental research and biotechnological applications. We originally isolated a novel EPS-producing microorganism, Sphingomonas chungbukensis DJ77 We also observ

During the last decades, several extracellular polysaccharide (EPS)-producing microorganisms have gained increasing interesting, both for fundamental research and biotechnological applications. We originally isolated a novel EPS-producing microorganism, Sphingomonas chungbukensis DJ77 We also observed that S. chungbukensis DJ77 is capable to produce extracellular. polysaccharide (EPS) for a potential gelling agent in food and other industries. In this study, we extensively carried out a genome-sequencing project of S. chungbukensis DJ77 and investigated the expression profile of several genes involved in the biosynthesis of EPS. We constructed both fosmid library and shot gun library of S. chungbukensis DJ77 and investigated several fosmid clones (i.e. FA494, 606, 421, 372, 338 etc.). In particular, we reported several key genes for the biosynthesis of EPS by using colony hybridization and significantly constructed the EPS cluster database of S. chungbukensis DJ77 from comparative genomic analysis with Sphingomonas elodea ATCC 31461 EPS cluster In addition, metabolic enzymes and their genes for the biosynthesis of EPS were extensively investigated and characterized their cellular functions based on public D/B of Sphingomonas sp.. Sequence homology between S. chungbukensis DJ77 and other Sphingomonas sp. were evaluated and classified with respect to metabolic functions by using blastp of COGs D/B algorism and MySQL, respectively (i.e. related genes of 197 and their information were acquired from comparative genomic approaches with Sphingomonas sp. of 14). Furthermore, we successfully predictedthe metabolic pathway of S. chungbukensis DJ77 for the biosynthesis of EPS from the systematicanalysis of xanthan, gellan, and succinoglycan pathways. Interestingly, we have identified genes (i.e. pmmC, spsA, spsB, gelA, gelN and gelM) for overproduction of EPS and these genes(i.e. EPS biosynthesis-related genes, export-related genes, and priming genes)successfully cloned into wild S. chungbukensis DJ77 strain by in vivo transformation procedure. On the other hand, we also investigated the metabolic pathway and related-genes for the production of one of the value-added polysaccharides, levan, which is a fructose polymer with potential importance as a fructose source and as a thickening agent in food technology. In this study, the overall protein expression pattern of recombinant S. chungbukensis DJ77 strain was studies by using SEM/TEM and two-dimensional electrophoresis. The systematic approach to the monitoring of proteomic responses and the detailed anlysis results reported in this study would be useful in understanding the metabolic pathway for the biosynthesis of EPS and designing efficient fermentation strategies for the production of recombinant enzymes and metabolites using S. chungbukensis DJ77 strain through a detailed analysis of transcriptomic responses at the gene expression level.

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과제의 개요...17
• 제 1 절 연구 개발의 필요성...17
• 제 2 절 연구개발의 목표 및 내용...19
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...21
• 제 1 절 국외의 경우...21
• 제 2 절 국내의 경우...22
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...23
• 제 1 절 연구범위 및 연구수행방법...23
• 제 2 절 연구수행 내용 및 결과...52
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...250
• 제 1 절 연구개발목표의 달성도...250
• 제 2 절 관련분야의 기여도...251
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...258
• 제 1 절 산업적 측면...258
• 제 2 절 기술적 측면...259
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...260
• 제 1 절 EPS의 종류 및 특성...260
• 제 2 절 EPS 과생산을 위한 유전학적 방법...261
• 제 7 장 참고문헌...263