초록 ▼

$\bullet$ 세포 내부의 단백질 분해효소의 특성을 유전학적 방법으로 연구 할 수 있는 새로운 방법 개발 (GASP).
$\bullet$ HCV NS3 단백질 분해효소, TuMV NIa 단백질 분해효소, Coxsackievirus와 Mengovirus의 3C 단백질 분해효소들의 기질특이성을 GASP의 방법으로 분석.
$\bullet$ GASP의 방법을 이용 Degradomics 수행하여 C.elegans의 CED-3 단백질 분해효소의 기질을 탐지 및 분석

$\bullet$ 세포 내부의 단백질 분해효소의 특성을 유전학적 방법으로 연구 할 수 있는 새로운 방법 개발 (GASP).
$\bullet$ HCV NS3 단백질 분해효소, TuMV NIa 단백질 분해효소, Coxsackievirus와 Mengovirus의 3C 단백질 분해효소들의 기질특이성을 GASP의 방법으로 분석.
$\bullet$ GASP의 방법을 이용 Degradomics 수행하여 C.elegans의 CED-3 단백질 분해효소의 기질을 탐지 및 분석
$\bullet$ Poly-glutamine disease를 치료할 수 있는 방법으로 새로운 단백질 분해효소를 TuMV NIa protease로부터 개발
$\bullet$ 치매에 관련되어진 BACE와 심장질환에 관련되어 있는 ADAM12 단백질 분해효소의 활성 측정 방법의 개발과 그에 대한 저해제 개발
$\bullet$ 세포외부의 단백질 분해효소의 특성을 유전학적 방법으로 연구 할 수 있는 새로운 방법 개발 (sGASP)
$\bullet$ sGASP을 사용, TMPRSS2, 3, 6 단백질 분해효소들의 활성 확인 및 특성 규명
$\bullet$ KEX2 단백질 분해효소의 기질특이성을 sGASP을 이용하여 변형 및 그에 대한 특성 연구
$\bullet$ 두개의 단백질 분해효소 활성을 확인할 수 있는 새로운 방법 개발 (Dual GASP)
$\bullet$ C99, presenilin, nicastrin의 상호 작용 탐지

Abstract ▼

Pretenses play essential roles in numerous biological processes and pathology of many diseases. for example, human immunodeficiency virus (HIV) and hepatitis C virus, encode own protease which is critical fro proper viron assembly and maturation. Therefore, these viral protease has been considered a

Pretenses play essential roles in numerous biological processes and pathology of many diseases. for example, human immunodeficiency virus (HIV) and hepatitis C virus, encode own protease which is critical fro proper viron assembly and maturation. Therefore, these viral protease has been considered as a promising target for the rational drug development. Tn this study, we have developed a genetic assay for site-specific proteolysis (GASP). We proposed that GASP may be useful to detect and characterize proteolysis in yeast. The resulting information should be beneficial for the understanding the molecular mechanism of protease activity and further development of protease inhibitors.
We showed that GASP worked nicely as we proposed and the substrate specificity of viral proteases such as HGV NS3 protease, TuMV na protease, Coxsackievirus 3C protease, and Mengovirus 3C pretense has been investigated using GASP.
For degradomics approach, we examined the possibility of employing GASP for the screening of relevant substrates. The C.elegans cell death pretense, CED-3 was used as model system. Using C.elegans genomic library, we were able to obtain eight candidates from half million transformants. Among candidates, three clones were confirmed by in-vitro cleavage assay. Another library which is cDNA library, was used for degradomics approach. One candidate could Ire isolated from million transformants, this clone showed having a correlation with cell death signal.
Another approach is protease engineering for removing disease-related proteins such as poly-glutamine protein. For designing poly-Q pretense (refer PQP), we used the rational randomization. Through screening using GASP, modified protease which can cleave poly-glutamine stretch, could be obtained.
Beside GASP, we have performed inhibitor development for disease related pretenses which were BACE and ADAM12. For this approach, GASP has been applied to a S2 cell. The S2 cell-based assay was utilized and candidates for BACE and ADAM12 were discovered.
We further developed another genetic method referred to as sGASP (secretory GASP). The purpose of sGASP is to detect and study proteolysis conferred by membrane anchored or secreted protease such as type II membrane serine pretense and beta site APP cleaving enzyme (BACE). Using sGASP, we were able to investigate pretense activity of TMPRSSs (TransMembrane PRoteaSe, Serine) which are type II membrane serine pretenses. Another approach is generation of nobel protease. Using sGASP, we successfully developed novel protease derived KEX-2 using rational randomization and its substrate specificity was altered.
In addition to GASP and sGASP, we used a split-ubiquitin technique which is capable of detecting interaction between membrane protein. Using this method, we characterized the interaction between C99, presenilin, and nicastrin.

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과제의 개요...14
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...20
• 제 1 절 Genetic Assay for site-specific proteolysis (GASP)...20
• 제 2 절 Secretory GASP (sGASP)...21
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...23
• 제 1 절 GASP을 이용한 pretenses 연구...23
• 1. GASP을 이용한 substrate specificity 연구...23
• 가. Hepatitis G Virus NS3 protease...23
• 나. Turnip Mosaic Virus NIa protease...25
• 다. Coxsackievirus 3C protease...26
• 라. Mengovirus 3C protease...27
• 2. GASP을 이용한 Degradomics 연구...29
• 가. Degradomics 기술 확립 및 C.elegans의 CED3 pretense의 기질 탐지...29
• 3. GASP을 응용한 S2 cell based assay...34
• 가. BACE protease를 이용한 기술의 확립...34
• 나. ADAM12 pretense...35
• 4. GASP을 이용한 pretense engineering...37
• 가. Poly Q protease (PQP) 개발...37
• 나. Poly A protease (PAP) 개발...41
• 5. GASP을 응용한 Dual GASP system 개발...43
• 가. Dual GASP system 확립...43
• 6. split-ubiquitin assay를 통한 C99, presenilin, nicastrin의 상호작용에 관한 연구...45
• 가. split-ubiquitin assay...45
• 나. C99, presenilin, nicastrin 상호 결합...45
• 다. C99에 결합하는 nicastrin의 binding domain 탐지...46
• 제 2 절 sGASP을 이용한 pretense 연구...48
• 1. sGASP 방법의 확립 및 TMPRSSs에 관한 연구...48
• 가. sGASP의 방법 확립...48
• 나. TMPRSS2의 substrate specificity 연구...49
• 다. TMPRSS3의 활성과 청각장애와의 관계 연구...52
• 라. TMPRSS6의 유전자 클로닝과 그 활성 연구...53
• 2. sGASP을 of용한 pretense engineering...55
• 가. KEX-2를 이용한 기질 특이성 변형에 관한 연구...55
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...57
• 제 1 절 목표달성도...57
• 제 2 절 관련분야에의 기여도...58
• 1. Degradomics 기술 개발...58
• 2. BACE 및 ADAM12의 inhibiter 발굴에 사용할 수 있는 high throughput system (HTS) 개발...58
• 3. sGASP의 기술의 정립...58
• 4. pretense engineering 기술 확립...59
• 5. Dual GASP 기술 확립...59
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...60
• 제 1 절 Degradomics...60
• 제 2 절 Protease inhibiter 발굴...60
• 제 3 절 Pretense engineering...60
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...62
• 제 7 장 참고문헌...63