초록 ▼

1. 천연 단백분해효소 저해제의 대량생산 및 수산식품에의 응용 기술 개발
가. 수산동물 (명태, 도치, 도루묵, 물곰치, 빙어, 연어) 알의 단백분해효소저해제의 검색
수산동물의 알을 이용하여 단백분해효소를 column chromatography로 분석하여 분리 정제하여 단백분해효소 저해활성 측정 방법을 확립 (Papain activity 저해 활성측정)하고 HPLC, SDS-electrophoresis를 행하여 단백분해효소 저해제의 순도 및 분자량 측정을 확립하였다.
나. 수산동물에 함유된 천연 단백분해효소저해제의

1. 천연 단백분해효소 저해제의 대량생산 및 수산식품에의 응용 기술 개발
가. 수산동물 (명태, 도치, 도루묵, 물곰치, 빙어, 연어) 알의 단백분해효소저해제의 검색
수산동물의 알을 이용하여 단백분해효소를 column chromatography로 분석하여 분리 정제하여 단백분해효소 저해활성 측정 방법을 확립 (Papain activity 저해 활성측정)하고 HPLC, SDS-electrophoresis를 행하여 단백분해효소 저해제의 순도 및 분자량 측정을 확립하였다.
나. 수산동물에 함유된 천연 단백분해효소저해제의 분리 및 정제
단백분해효소저해제 정제 및 특성실험을 하였으며, 저해효과 및 저해기작 분석하였다. 합성 및 천연 물곰치알 단백분해효소저해제의 효과 및 저해기작 실험을 하였으며, Cathepsin 및 trypsin에 대한 물곰치알 저해제의 저해활성을 비교분석하였다. 상업용 제품(Egg white 및 potato inhibitor)과의 비교 실험도 병행하였다.
다. 분리된 천연 효소저해제의 효과 및 저해기작 평가
Ki and Vmax value 측정에 의한 저해기작을 평가하였고, 온도, pH 및 수분활성의 영향 분석하였다.
라. 효과가 우수한 수산물 유래 저해제의 아미노산배열 분석, 유전자 동정 및 PCR을 통한 유전자 복제
물곰치 저분자 단백분해효소저해제의 아미노산배열 분석, 유전자 동정 및 PCR을 통한 유전자 복제실험을 하였으며, E. coli 균에 대한 cloning을 하였다. Cloned E. coli 균으로부터 재조합 단백분해효소저해제의 최적 배양조건을 확립하여 재조합 단백분해효소저해제의 정제 및 활성 비교 실험을 하였으며, Calpain inhibitor의 저해활성 비교실험도 행하였다.
마. 연어알 단백분해효소 저해제의 재조합 효모의 발효공정 및 효소저해제 생산의 최적화
효모에 발현된 연어알 단백분해효소 저해제의 배지 조성 및 배양조건의 최적화를 확립하였다.
바. 재조합 미생물의 발효를 통한 천연 효소저해제의 대량생산공정과 분리 정제기술의 확립
연어알 단배분해효소 저해제의 정제 방법 및 저해활성을 연구하였다.
사. 재조합 효소저해제가 함유된 수산식품의 품질향상
단백분해효소저해제를 첨가한 surimi를 제조하여 품질 특성 실험을 하였으며, 화장품 관련 효소에 대한 저해활성 실험을 하였다.
2. 단백분해효소 저해제의 대량 생산 및 생산 공정의 최적화
가. 해조류(홍조 및 녹조)로부터 단백분해효소 저해제를 검색
해조류 2종(홍조인 방사무늬 김, 녹조인 창자파래)으로부터 단백질분해효소 저해제를 확인하고 단백질분해효소 저해활성을 측정하였다.
나. 해조류에 함유된 단백분해효소저해제의 분리 및 정제
홍조류(P. yezoensis and tenera) 및 녹조류(E. intestinalis)의 단백분해효소저해제 효과의 비교 평가를 행하였으며, P. yezoensis로부터의 단백질분해 효소저해제 분리 공정 효율을 평가하였다.
다. 해조류 효소저해제의 효과 및 저해기작 평가
P yezoensis의 단백분해효소저해제의 특성을 온도 및 산도(pH)에 따라 beef plasma protein, egg white, potato powder 등 기존의 농 축산물 유래 저해제와 비교 평가하였다.
라. 물곰치 단백분해효소 저해제의 N-terminal 분석 및 합성
물곰치 알로부터 유래되는 단백분해효소저해제의 N-terminal을 근거로 peptide 합성을 행 하였다.
마. 연어알 단백분해효소저해제의 재조합 벡터 및 재조합 효모 개발
Cystatin 발현 벡터 pYES2/NT_C (cystatin)를 효모(S. cerevisiae YPH499)에 형질전환 하였으며, 재조합 벡터를 제작해 효모에서 발현하였다.
바. 물곰치알 재조합 벡터 및 재조합 효모 개발
재조합 벡터를 제작하여 물곰치 유래 단백분해효소저해제의 형질이 전환된 효모를 개발연구를 하였다.

Abstract ▼

Surimi, a stabilized fish myofibrillar protein, is the primary ingredient in surimi-based products. Gel functionality, such as texture and color, of surimi seafood is the most important aspect of product quality. However, autolysis by endogenous heat stable proteases causes an irreversible destructi

Surimi, a stabilized fish myofibrillar protein, is the primary ingredient in surimi-based products. Gel functionality, such as texture and color, of surimi seafood is the most important aspect of product quality. However, autolysis by endogenous heat stable proteases causes an irreversible destruction of the surimi gel structure, especially at temperatures close to $60^{\circ}C$. This gel softening of surimi-based product is called as "modori phenomenon". Therefore, surimi industry have been using the commercial protease inhibitors to prevent modori (gel softening) phenomenon and to maximize the gel strength of surimi. The most commonly used inhibitors are bovine plasma protein (BPP), chicken egg white protein, potato powder, and whey protein concentrate. Because there is some side effect on surimi-based product such as change of color when these protease inhibitors were applied, fish pretense inhibitor is thought to be the best one to prevent modori phenomenon.
The inhibitor of cysteine protease was first isolated from chicken egg white in 1968. This inhibitor was further characterized as cystatin classified as the first member of the cystatin superfamily. The cystatin superfamily is divided into three structurally related families; stefins, cystatins, and kininogens. Family 1 (stefin) lacks both disulfide bridges and carbohydrates. Stefin has a molecular mass of around 11 kDa, is the smallest in the cystatin superfamily. Family II (cystatin) is also single chain with one domain protein and about 2 kDa larger than the family I inhibitor. The polypeptide chains of cystatins contain two disulfide bonds near their C-terminus. Family III (kininogen) consists of a N-terminal heavy chain combined with a variable length light chain. The heavy chain has three cystatin-like domains. Based on the length of the light chain, the kininogen is divided into two sub-families; a high molecular weight kininogen (HMW klnlnogen, $\sim$ 120 kDa) and a low molecular weight kininogen (LMW kininogen, $\sim$ 68 kDa).
The interaction between proteases and their inhibitors was a target of intensive study for the last two decades. Protease inhibitors were purified from ovarian fluid carp, egg and muscle of chum salmon, muscle of white croaker, Atlantic salmon and Arctic charr, and hake, Argentine anchovy, castaneta, rough sead, and sea trout.
In this study, protease inhibitors with strong inhibitory activity against cysteine proteases causing the gel softening of surimi-based product were screened from different fish eggs and seaweed and then determined their characteristics. Some protease inhibitors were cloned in microorganism for mass production, which was then applied to surimi-based product and compared with other commercial inhibitor.

목차 Contents

• 제 1 장 서론...28
• 제 1 절 연구목적...28
• 제 2 절 연구개발 필요성...29
• 제 3 절 연구개발 범위...34
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...37
• 제 1 절 국내 기술 현황...37
• 제 2 절 국외 기술 현황...38
• 제 3 절 참고문헌...41
• 제 3 장 수산동물 유래 단백분해효소 저해제의 개발 및 수산식품에의 응용...49
• 제 1 절 명란(Alaska pollock egg)으로부터 단백분해효소 저해제 정제 및 특성...49
• 1. 서론...49
• 2. 재료 및 방법...50
• 3. 결과 및 고찰...51
• 4. 참고 문헌...58
• 제 2 절 물곰치알 (Glassfish egg)로부터 저분자단백분해효소저해제 (Low-molecular weight protease inhibitor) 정제 및 구조 분석...60
• 1. 서론...60
• 2. 재료 및 방법...61
• 3. 결과 및 고찰...64
• 4. Conclussions...73
• 5. 참고문헌...73
• 제 3 절 물곰치알 (Glassfish egg)로부터 고분자단백분해효소저해제 (Hig molecular weight protease inhibitor) 정제 및 구조 분석...77
• 1. 서론...77
• 2. 재료 및 방법...78
• 3. 결과 및 고찰...81
• 4. 참고문헌...86
• 제 4 절 연어알 (Salmon egg) 단백분해효소저해제의 정제 및 특성...91
• 1. 서론...91
• 2. 재료 및 방법...92
• 3. 결과 및 고찰...95
• 4. 참고문헌...100
• 제 5 절 기타 어종 단백분해효소저해제 정제 및 특성...104
• 1. 서론...104
• 2. 재료 및 방법...105
• 3. 결과 및 고찰...108
• 4. 참고문헌...114
• 제 6 절 재조합 E.coli로부터 물곰치 단백분해효소저해제 정제...118
• 1. 서론...118
• 2. 재료 및 방법...120
• 3. 결과 및 고찰...122
• 4. 참고문헌...128
• 제 7 절 재조합 효모의 연어알 단백분해효소저해제의 특성...137
• 1. 재조합 효모를 사용한 plasmid의 안정성...137
• 2. Over expression의 최적화...138
• 3. 재조합 cystatin의 정제 및 특성...138
• 제 8 절 천연 효소저해제가 함유된 수산식품의 품질 향상 연구...140
• 1. 서론...140
• 2. 재료 및 방법...141
• 3. 결과 및 고찰...146
• 4. 참고문헌...153
• 제 9 절 화장품 및 젓갈관련 단백분해효소저해활성 비교 효소 저해활성...157
• 1. Elastase의 저해활성...157
• 2. Collagenase의 저해활성...158
• 3. Tyrosinase의 저해활성...158
• 제 10 절 송어 혈장 단백질의 특성...159
• 1. Surimi-gel의 텍스쳐 향상에 어류 plasmid가 미치는 영향...159
• 2. Surimi-gel의 미백과 수분 보유력에 어류 plasmid가 미치는 영향...159
• 3. Surimi-gel의 단백질 degraddation에 어류 plasmid가 미치는 영향...160
• 제 4 장 단백분해효소저해제의 대량생산 및 생산 공정의 최적화...161
• 제 1 절 김(홍조류) 및 파래(녹조류)에서 단백분해효소저해제의 정제 및 활성 연구...161
• 1. 김 유래 단백분해효소 저해제...161
• 2. 파래 유래 단백분해효소 저해제...163
• 제 2 절 해조추출물의 단백분해효소 저해효과 및 해조유래 저해제와의 특성비교...164
• 1. 실험재료 및 방법...164
• 2. 연구결과...167
• 제 3 절 S. cerevisiae에 의한 재조합 연어 cystatin 생산을 위한 대량발효와 배양공정의 최적화...176
• 1. 서론...176
• 2. 실험재료 및 방법...177
• 3. 결과 및 고찰...179
• 4. 참고문헌...188
• 제 5 장 목표달성도 및 관련 분야에의 기여도...191
• 제 1 절 연구목표 및 내용...191
• 1. 연구 목표...191
• 2. 연구 내용...191
• 제 2 절 평가착안점...194
• 제 3 절 목표달성도 및 관련분야 기여도...195
• 1. 연구개발목표의 달성도...195
• 2. 관련분야 기여도...196
• 제 6 장 연구개발결과의 활용개획...197
• 제 7 장 해외과학기술정보...198