초록 ▼

$\blacktriangleright$ 방사성 동위원소를 이용한 생체분자(kinase 등)와 기질(peptide 등)간의 상호작용 여부 규명
- 방사성 동위원소 검출이용 kinase-substrate 상호작용 여부를 규명하기 위하여, 첫째, 반응에 필요한 컨텐츠의 확보를 위하여 E. coli malic enzyme-kemptide 융합단백질을 제조하였다.
- 둘째, 방사성 동위원소 $[\gamma-^{32}P]ATP$를 이용하여 효소(cAMP-dependent protein kina

$\blacktriangleright$ 방사성 동위원소를 이용한 생체분자(kinase 등)와 기질(peptide 등)간의 상호작용 여부 규명
- 방사성 동위원소 검출이용 kinase-substrate 상호작용 여부를 규명하기 위하여, 첫째, 반응에 필요한 컨텐츠의 확보를 위하여 E. coli malic enzyme-kemptide 융합단백질을 제조하였다.
- 둘째, 방사성 동위원소 $[\gamma-^{32}P]ATP$를 이용하여 효소(cAMP-dependent protein kinase; PKA)와 기질(E. coli malic enzyme-kemptide 융합 단백질 및 kemptide)의 인산화반응을 통하여 상호작용 여부를 규명하였다.
$\blacktriangleright$ 단백질 chip 상의 적용을 위하여 방사성 동위원소를 이용한 생체분자와 기질간의 상호작용 분석법 확립
- Chip 상에서 방사성 동위원소를 이용한 인산화반응의 상호작용 분석 확립을 위한 최적의 기질(E. coli malic enzyme-kemptide 융합단백질 및 kemptide) 고정화 조건을 확립하였다.
- 0.1 uCi/ul $[\gamma-^{32}P]ATP$의 농도에서도 뚜렷이 스팟 시그널을 확인하였다.
($[\gamma-^{32}P]ATP$의 농도가 높아질수록 비례적으로 방사성 강도가 증가)
- 0.4 uCi/ul $[\gamma-^{32}P]ATP$의 농도조건에서 최소 0.1 U/ml 농도의 효소(PKA)에서 검출한계를 나타내었다.
- 형광분석법 대비 감도 30배 이상의 시그널을 획득하였다.
$\blacktriangleright$ 생체분자와 기질간의 상호작용 시의 고유한 조건 및 특성에 방사성 동위원소 이용 기술의 우수성 검증
- 비특이적 결합의 최소화를 위한 칩 표면 처리조건 확립하였다.
- $[\gamma-^{32}P]ATP$을 이용한 인산화반응시 blocking 단계를 생략한 검출공정의 단순화 조건 확립하였다.
- 방사성 동위원소를 이용하여 필름에 비해 감광시간이 약 43%밖에 안되는 IP에서도 뚜렷한 시그널을 나타내었다.

Abstract ▼

Microarrays have recently become a precious research tool for proteomics and clinical investigation. Their applications to the diagnosis of a disease have emerged as a significant promise for medical advances. In this study, we report on an efficient strategy for the detection of phosphorylation of

Microarrays have recently become a precious research tool for proteomics and clinical investigation. Their applications to the diagnosis of a disease have emerged as a significant promise for medical advances. In this study, we report on an efficient strategy for the detection of phosphorylation of a substrate catalysed by kinase, using radioisotope detection technique for a protein biochip. This technique does not employ the use of the blocking step which is commonly used in conventional methods to prevent non-specific binding. It was found that the usage of a radioisotope detection technique has the advantages of being highly sensitive and time saving when compared to other conventional methods. The results can be applied when using radioisotope detection technique to develop biochips to determine the activity of a protein kinase. Further, it can be a useful tool for a high throughput screening and for studying protein-protein interactions.

목차 Contents

• 방사성동위원소의바이오칩적용유효성검증연구...1
• 제출문...2
• 보고서초록...3
• 요약문...4
• SUMMARY...6
• COTENTS...7
• 목차...8
• 제 1 장 연구개발과제의 개요...10
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...13
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...16
• 가. 연구수행 방법...17
• (1) Chemicals, peptides, protein...17
• (2) 균주와 plasmid...17
• (3) 클로닝된 plasmid DNA의 분리...22
• (4) E. coli malic enzyme-kemptide 융합 단백질의 생산 및 정제...22
• (5) Fusion peptide-protein microarray의 제조...22
• (6) $[\gamma-^{32}P]ATP$를 이용한 키나아제-기질의 인산화반응 조건 확인...23
• (7) 형광색소(Cy3, Cy5)를 이용한 기질과 kinase 반응의 검출...23
• 나. 연구수행 결과...28
• (1) E. coli malic enzyme-kemptide 융합 단백질의 정제...28
• (2) cAMP-dependent protein kinase(PKA)의 인산화반응에 방사성 동위원소 $[\gamma-^{32}P]ATP$의 적용 유효성...29
• (3) 슬라이드 종류에 따른 바이오칩 적용성 비교...30
• (4) cAMP-dependent protein kinase(PKA)의 인산화반응에서 $[\gamma-^{32}P]ATP$ 농도에 따른 방사성 강도...31
• (5) 슬라이드 백그라운드를 위한 여러가지 blocking 용액의 효과...32
• (6) 인산화반응에서 cAMP-의존 단백질 키나아제의 농도에 따른 방사성 강도...32
• (7) $[\gamma-^{32}P]ATP$를 이용한 인산화반응 시간에 따른 방사성 강도 패턴...35
• (8) 검출기술에 대한 감도비교...36
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...38
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...40
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...42
• 제 7 장 참고문헌...43