초록 ▼

본 연구의 목적은 높은 농도의 중금속을 함유하고 있는 퇴적환경을 대상으로 중금속이 저서 생태계에 미치는 영향을 정확히 평가하기 위해 저서생물의 세포내 분자적인 단계에서의 생화학적 조사를 하는 데에 있으며 이를 위해 두줄박이참갯지렁이(Neanthes succinea)와 참갯지렁이(Perinereis nuntia)를 대상 종으로 하여 중금속 농도와 생체 지표, 유전자를 분석하였다.
1. 저서동물 서식현황
1차년도 연구에서는 연구 대상 생물 선택 및 시화호의 현재 생태계 상황을 파악하기 위한 조사였으며 2차 년도에서는 시화호의

본 연구의 목적은 높은 농도의 중금속을 함유하고 있는 퇴적환경을 대상으로 중금속이 저서 생태계에 미치는 영향을 정확히 평가하기 위해 저서생물의 세포내 분자적인 단계에서의 생화학적 조사를 하는 데에 있으며 이를 위해 두줄박이참갯지렁이(Neanthes succinea)와 참갯지렁이(Perinereis nuntia)를 대상 종으로 하여 중금속 농도와 생체 지표, 유전자를 분석하였다.
1. 저서동물 서식현황
1차년도 연구에서는 연구 대상 생물 선택 및 시화호의 현재 생태계 상황을 파악하기 위한 조사였으며 2차 년도에서는 시화호의 현재 저서 생태계를 이해하기 위한 조사로서 1차년도의 연구에 이어 대형저서동물을 대상으로 생태계 모니터링을 실시하였다. 2006년 5월 19일, 9월 23일, 10월 30일 3회에 걸쳐 시화호 내해 7개 정점에서 시료를 채집하였으며 $0.1m^{2}$ 면적의 반빈 채니기(Van veen grab)을 이용하여 3회 반복해서 퇴적물을 채취하고 1mm 의 표준체를 이용하여 선상에서 체 질 후 남은 잔존물을 10% 포르말린용액으로 고정하여 실험실로 운반하였다. 실험실로 운반된 시료를 실체현미경하에서 관찰함으로서 분류군별로 선별 및 동정 계수하였으며 동정은 가능한 종까지 구분하려 하였다. 저서동물의 공간적 분포 특성을 파악하고 정점별 출현 종수, 개체 수, 분류군별 구성비율 그리고 우점종의 분포 특성들을 분석하였다.
2. 소형 생태계 실험
1) 대상생물
대상생물은 시화호에 서식하는 Neanthes succinea(두줄박이눈썹참갯지렁이)와 배양되어 판매되는 종인 Perinereis nuntia(참갯지렁이)로 참갯지렁이과(Nereidae(Johnston, 1865))에 속하는 두 종의 갯지렁이를 이용하였다.
현장 퇴적물에의 배양실험에는 시화호에 Cirratulus cirratus(가는실타래갯지렁이)을 채집하여 체내 금속 및 생체지표를 분석에 이용하였다.
2) 갯지렁이 체내 Metallothionein 유도 실험
2차 년도에는 1차 년도의 생체지표 분석 결과의 계산식 수정과 함께 체내 중금속 농도를 추가로 분석하여 그 관계를 보았으며 2차년도 중금속 노출 실험의 결과와 함께 토의하였다.
3) 중금속 독성실험
카드뮴(Cd)과 구리(Cu), 두 종의 중금속에 대해 갯지렁이 중금속 노출 실험을 실시하였다. 배양 가능종인 Perinereis nuntia(참갯지렁이)를 이용하였다.
해수의 카드뮴 농도는 25, 50, 100, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, $25000{\mu}g/L$ Cd의 농도를, 구리는 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 25000 그리고 $50000{\mu}g/L$ Cu로 각각의 경우 총 9개의 농도 구배를 두었다. 그리고 구리와 카드뮴이 동일 농도 함께 작용할 때의 영향을 알아보기 위해 $500{\mu}g/L$ Cd과 $500{\mu}g/L$ Cu가 섞인 해수에서의 배양도 실시하였다. 중금속을 제외한 모든 환경을 동일하게 유지 시키면서 7일간 배양하고 실험 동안 개체 수준의 지표로서 형태학적인 변화와 치사율을 관찰하였으며 96시간(4일)과 7일째 체내 중금속 및 metallothionein분석을 실시하였다.
4) 시화호 현장 퇴적물 소형 생태계 실험
순치 시킨 갯지렁이를 시화호에서 채취해 온 현장의 퇴적물시료를 이용하여 소형생태계 실험을 실시하였다. 퇴적물은 상대적으로 깨끗한 정점과 시화호 정점 중 중금속 농도가 가장 높은 상류 지역으로 나누었다. 이 같은 퇴적물의 특징을 알기 위해 퇴적물 내의 유기물 함량, 입도, 중금속을 분석하였다. 배양실험은 각각의 퇴적물에 배양종 P. nuntia 30개체와 시화호 내해의 갑문 근처에서 서식하고 있던 Cirralutus cirratus 2개체씩을 넣어준 후 약 한 달 동안 진행되었다.
3. 시화호 서식 개체 내 중금속 및 생체지표 실험
시화호의 7개 정점에서 개체 크기 별, 정점 별 중금속 농도 및 생체지표 분석을 위한 시료를 채취한 후 분석을 위해 개체 크기별로 나누었으며 이는 무게와 길이를 기준으로 하였다. 탈장 후에 분석 전까지 $-80^{\circ}C$에 보관하였다. 중금속과 생체지표의 분석은 1차 년도의 결과를 보완하기 위해 각 정점에서 크기 및 질량별로 구분하여 분석하였다.
각 정점에서 채집 된 생물의 존재 여부에 따라 개체를 나누었으며, 시료 한 개에는 생물의 질량에 따라 개체수를 $1{\sim}8$개를 합하여 총 122개체를 분석에 이용하였다.
1) 중금속
1차년도 카드뮴 노출실험에 이용한 P. nuntia(참갯지렁이) 체내 중금속 농도를 추가로 분석하였다. 그리고 2006년 5월 현장에서 채집한 생물은 현장의 여과된 해수로 생물을 깨끗이 씻은 후 장 내의 퇴적물이나 기타 섭취 물질을 제거하기 위해 약 24시간 동안 현장의 해수에 두어 탈장을 시켰다. 탈장 후 $-81^{\circ}C$의 냉동고에 동결시킨 후 동결건조기를 이용하여 건조시켰다. 실내 중금속 노출 실험의 개체도 $-81^{\circ}C$에서 동결시킨 후 건조시켰다. 건조된 시료를 유리막대를 이용하여 곱게 간 해양환경공정시험법(2002, 해양수산부)에 의거하여 65%의 유해 중금속 분석 이상 등급의 질산으로 약 48시간 동안 가열하였다. 퇴적물은 총 금속 량을 측정하기 위해 각각의 정점에서 채취한 시료를 질산(65%)과 염산(30%), 과염소산(70%), 불소산(48%)를 이용하여 가열하였다(해양수산부, 2002). 분석 항목은 Cd, Cu, Zn, Pb, As, Mn 등 6항목으로 분석은 한국기초과학지원연구센터에 의뢰하여 유도결합플라즈마(ICP-MS)를 이용하여 측정하였다.
2) 생체지표: Metallothionein
생물체 내에서 금속과 결합하고 있는 sulfhydryl 기(-SH)를 측정하여 이를 통해 metallothioenin을 분석하는 것으로 시료 내의 sulfhydryl 기의 농도는 DTNB(5,5-dithiobis-2-nitrogen benzoic acid; Ellman`s reagent)(Ellman, 1958)로 발색 후 412nm(pH 8)에서 흡광도를 측정하였으며 reduced glutathione(GSH)를 standard로 이용하였다.
원리는 GSH의 cystein(SH기)을 정량함으로서 그 농도를 측정하는 것으로 Metallothionein의 농도는 MT를 구성하는 아미노산의 약 30%에 해당되는 20moles SH가 존재한다는(Dieter et al., 1987)것을 기초로 하였다. 본 연구에서는 무척추 동물의 MT 관련 논문에서 사용되었던 값을(약 29%의 cystein 함량) 참고하여(Mackay et al., 1993; Viarengo et al., 1997) MT를 정량하였다.
4. 중금속 반응 유전자의 특성 규명
1) 갯지렁이로부터 total RNA의 추출 및 갯지렁이 cDNA library의 제작 및 발현유전체 클로닝
갯지렁이로부터 total RNA를 추출하기 위하여 갯지렁이 전체 무게의 3배수의 Trizol을 첨가하여 homogenizer로 균질화시켰으며, 균질화된 갯지렁이로부터 일반적인 RNA 추출방법에 따라서 total RNA를 추출하였다. 시화호 내의 중금속에 반응하는 유전자를 찾기 위해 우선 갯지렁이의 ${\lambda}cDNA$ library를 중금속에 노출된 갯지렁이로부터 제작하였다. 이때, 유전체의 coding region을 손쉽게 분석하기 위해 $5`{\rightarrow}3`$ 쪽으로 unidirection하게 방향성을 집어넣고 갯지렁이의 ${\lambda}cDNA$ library를 제작하였다.
2) 갯지렁이 발현 유전체의 분석
갯지렁이 cDNA library를 helper phage를 이용하여 pBluescript로 전환시킨 후, 이를 다시 plasmid 형태로 전환시킨 후 삽입된 유전자를 random하게 선별하여 갯지렁이만의 고유한 발현유전체 35개를 확보해 분석하였다.
3) 갯지렁이 Biomarker genes 확보
먼저 갯지렁이의 cDNA library로부터 를 확보하였다. 또 다른 biomarker 유전자를 확보하기 위해 degenerate PCR을 통하여 GST-omega type, MnSOD, Cu/ZnSOD, metallothionein, catalase, Heat shock protein 70, calmodulin 등 중요한 biomarker 유전자들을 확보하였다.
이 중에서 GST theta는 protein level에서 biomarker로서의 기능성을 확인하였고, GST omega는 현재 kinetic activity test 중에 있으며, 나머지 유전자들은 real-time RT-PCR 등의 방법으로 발현 양상을 확인하였다.
4) 중금속 처리시 Biomarker 유전자들의 발현양상
시화호에서 채취한 갯지렁이를 3일 동안 해수에 정치한 후, 각각 3마리씩 다양한 구리농도에 노출시킨 후, Total RNA를 추출하여 real-time RT-PCR로 대상 유전자들의 발현양상을 알아보았다. 사용한 구리($CuCl_{2}$, Sigma)의 농도는 12, 32, $72{\mu}g/L$ 로 나누어 실험하였으며, 노출시간은 96시간으로 설정하고, control gene은 ${\beta}-actin$을 사용하였으며, RNA를 추출하여 정량 후 1차 cDNA를 만들어 실험하였다.
5) 지역별 Biomarker 유전자들의 발현 양상
안산 시화호 내 3지역(Site 2, Site 3, Site 6)에서 채집한 갯지렁이의 RNA를 추출하여 real-time RT-PCR로 biomarker 유전자들의 발현양상을 알아보았다. 사용한 Biomarker 유전자는 Cu/ZnSOD, GST omega, GST theta를 이용해 지역별 발현 양을 알아보았다.

목차 Contents

• 제 1 장 서론...35
• 1. 연구배경 및 필요성...35
• 1.1 수 생태계 내에서 중금속이 저서 생태계에 미치는 영향...35
• 1.2 생물의 중금속 해독 기작...36
• 1.2.1 Metallothionein의 유도 및 특징...36
• 1.2.2 Metallothionein의 체내 생물학적 역할...36
• 1.3 퇴적 오염 평가(Sediment Quality Assessment)에서의 생체지표 연구의 필요성...37
• 2. 국내외 연구현황...39
• 2.1 국내 연구 현황...39
• 2.2 외국의 연구 현황...39
• 3. 연구 목적 및 추진 전략...41
• 3.1 연구목적...41
• 3.2 추진전략...42
• 4. 기대효과...45
• 5. 연구범위...47
• 5.1 과업기간...47
• 5.2 지역적 범위...47
• 6. 연구의 내용 및 방법...50
• 6.1 저서 동물의 서식현황...50
• 6.2 소형생태계 중금속 노출 실험...51
• 6.2.1 대상생물...51
• 6.2.2 갯지렁이 체내 Metallothionein 유도 실험...52
• 6.2.3 중금속 독성실험...52
• 6.2.4 시화호 현장 퇴적물 소형 생태계 실험...52
• 6.3 시화호 서식 개체 내 중금속 생체지표 실험...54
• 6.4 중금속...54
• 6.5 생체지표: Metallothionein...55
• 6.6 중금속 반응 유전자의 특성 규명...57
• 6.6.1 갯지렁이로부터 total RNA의 추출 및 갯지렁이 cDNA library의 제작 및 발현유전체 클로닝...57
• 6.6.2 갯지렁이 발현 유전체의 분석...57
• 6.6.3 갯지렁이 biomarker genes 확보...57
• 6.6.4 중금속 처리시 Biomarker 유전자들의 발현양상...57
• 6.6.5 지역별 Biomarker 유전자들의 발현 양상...58
• 제 2 장 연구지역개관 및 생태계 조사...60
• 1. 시화호 지역 개관 및 연구 현황...60
• 2. 시화호 오염 현황...62
• 2.1 수층 및 퇴적물 내 중금속...62
• 2.2 생물체 내 중금속 농도...63
• 2.3 저서동물 서식현황...65
• 2.3.1 저서동물 조성...65
• 2.3.2 저서동물의 분포 특성...69
• 2.3.3 우점종 조성...72
• 2.3.4 종합...73
• 제 3 장 소형 생태계 실험을 통한 저서생물 체내 생체지표 연구...77
• 1. 소형 생태계 중금속 노출 실험...77
• 1.1 MT 유도 실험...77
• 1.1.1 카드뮴 노출 후 체내 중금속 및 생체지표 농도...77
• 1.2 중금속 독성 실험...80
• 1.2.1 형태학적 변화...80
• 1.2.2 치사율(Mortality)...83
• 1.2.3 체내 중금속 농도...84
• 1.2.4 생체지표 Metallothionein 농도...86
• 1.2.5 구리와 카드뮴의 동시 노출...88
• 1.3 시화호 현장 퇴적물 소형생태계 실험...90
• 1.3.1 치사율(Mortality)...92
• 1.3.2 체내 중금속 농도와 생체지표(metallothionein)...94
• 2. 시화호 서식 개체 내 중금속 및 생체지표 실험...99
• 2.1 시화호 퇴적물, 갯지렁이 체내 중금속 농도...99
• 2.1.1 퇴적물 내 중금속 농도...99
• 2.1.2 갯지렁이 체내 중금속 농도...101
• 2.2 생체지표...102
• 2.2.1 개체 크기와 체내 Metallothionein 함량 비교...102
• 2.2.2 갯지렁이 체내 중금속 농도와 MT 농도 비교...104
• 제 4 장 중금속 반응 유전자의 특성규명...108
• 1. 갯지렁이 cDNA library의 제작 및 발현유전체의 클로닝...108
• 2. 갯지렁이 발현유전체의 분석...109
• 3. 갯지렁이 biomarker genes 확보...116
• 3.1. 갯지렁이 Glutathione S-transferase theta protein characterization...116
• 4. 중금속 처리 시 Biomarker 유전자들의 발현양상...128
• 5. 지역별 Biomarker 유전자들의 발현 양상...130
• 제 5 장 결론...135
• 참고문헌...139