초록 ▼

조직공학제제는 인체의 결손된 기관 및 조직의 재생을 위하여 자가세포, 동종세포 또는 이종 세포를 지지체에 접종 배양한 인공 조직 또는 장기라고 정의할 수 있다. 다양한 첨단 생명공학 기술이 접목된 조직공학은 인체조직 또는 장기의 수요대비 공급불균형을 해결할 수 있으며, 기존의 연구나 치료기법으로 해결할 수 없는 의료영역에 대한 새로운 해법으로 평가되고 있다. 이 때문에 조직공학제제는 생명공학분야의 대표적 미래산업으로서 첨예한 국가간 개발경쟁이 이루어지고 있으며, 인공피부, 인공뼈, 인공연골 등이 이미 상품화되었고 이 분야 시장의 급

조직공학제제는 인체의 결손된 기관 및 조직의 재생을 위하여 자가세포, 동종세포 또는 이종 세포를 지지체에 접종 배양한 인공 조직 또는 장기라고 정의할 수 있다. 다양한 첨단 생명공학 기술이 접목된 조직공학은 인체조직 또는 장기의 수요대비 공급불균형을 해결할 수 있으며, 기존의 연구나 치료기법으로 해결할 수 없는 의료영역에 대한 새로운 해법으로 평가되고 있다. 이 때문에 조직공학제제는 생명공학분야의 대표적 미래산업으로서 첨예한 국가간 개발경쟁이 이루어지고 있으며, 인공피부, 인공뼈, 인공연골 등이 이미 상품화되었고 이 분야 시장의 급속한 성장이 예상된다. 그러나 새로운 분야인 만큼, 이러한 조직공학제제의 품질, 안전성 및 유효성을 평가할 수 있는 과학적 기준이 아직 정립되어 있지 않고, 각국의 규제방향도 상이한 실정이다. 이에 따라 조직공학제제, 특히 다양한 분화능을 가진 줄기세포를 이용한 조직공학제제를 과학적 사실에 근거하여 품질, 안전성, 유효성을 평가할 필요성이 대두되어, 골수유래 중간엽 줄기세포와 대표적 지지체를 이용한 인공연골모델을 제조하고 지지체에 따른 세포의 특성을 비교분석하였다.
인공연골모델의 소재로 사용된 중간엽 줄기세포의 확인은 형태학적 특성 뿐 아니라 FACS를 이용한 표면항원분석을 실시하였으며, 뼈, 연골, 지방세포로의 분화능 실험을 통하여 특성분석을 실시하였다. 지지체의 경우 천연고분자인 젤라틴과 합성고분자로 널리 사용되는 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid, 75:25)를 소재로 다공성 삼차원 스폰지 형태의 지지체를 제조하였으며, 각각의 지지체에 따른 미세구조를 SEM(scanning electron microscope)이미지를 통해 확인한 결과 젤라틴의 경우 interconnected structure를 이뤄 연골조직 생성이 PLGA에 비해 용이할 것으로 기대되었다. 이러한 각각의 지지체는 기공 특성 분석장치로 기공의 크기 및 공극률 측정하였으며, 평균 기공크기가 $170{\sim}220{\mu}m$, 공극율은 80%이상으로 측정되어 세포가 부착하여 성장하기 좋은 환경이라 평가하였다. 이러한 지지체에 골수유래 중간엽 줄기세포를 seeding하여 일정기간 연골조직으로 배양, 분화시킨 조직공학제제의 단면을 SEM 촬영 하여 기공구조 안에 세포가 들어가 부착하여 성장하는 것을 확인할 수 있었으며, 세포 생존률을 관찰한 결과 PLGA와 젤라틴 지지체 간의 유의한 차이는 없었으며, 생존율은 분화유도기간에 반비례하는 결과를 얻었다.
조직학 및 면역학적 평가에서는 H&E염색을 통해 지지체가 세포의 성장과 분화에 안정적인 구조물로 작용하고 있음을 확인하였고, 연골 특이적인 Alcian blue 염색으로 산성점액다당류를 염색하여 연골조직의 형성을 판단할 수 있었다. Collagen type II 및 Aggrecan을 표지자로 하여 면역염색을 실시한 결과 분화기간에 비례하여 발현정도가 높아지는 지는 경향을 보였으며, PLGA보다 젤라틴 지지체에서 보다 강하게 염색되는 것으로 젤라틴 지지체가 연골조직으로 분화하는데 좀더 적합한 지지체일것이라는 일차적인 평가 결과를 얻을 수 있었다.
이에 대해 기존의 평가방법과 차별화되는 high throughput screening방법인 human whole genome microarray을 이용하여 중간엽 줄기세포를 이용하여 분화시킨 연골조직과 분화 전 줄기 세포의 유전체패턴을 분석하고, 대조군으로 사람연골세포를 각각의 지지체에 동일하게 배양한 것을 기준으로 유전체의 발현 패턴을 분석하였다. 그 결과 분화 전 대비 분화 후 중간엽 줄기세포에서는 연골조직관련 유전자 및 세포분화관련 유전자들이 높게 발현되었고 세포주기와 성장에 관한 유전자 그룹이 낮게 발현되어 중간엽 줄기세포가 연골조직으로 분화되었음을 평가하는 지표로 활용할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 연골세포로 제조된 연골조직과 중간엽 줄기세포를 이용해 분화시킨 연골 조직 간의 유전체 발현 패턴을 조사한 결과 연골세포와? 상대적으로 낮음에도 불구하고 유사한 양상으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 대단위 유전자에 대한 분석은 특정 유전자에 대한 검증뿐 만 아니라 세포사멸, 종양 형성 등의 원하는 유전자에 대한 일차적 검증의 목적으로도 활용할 수 있으며, 새로운 환경적 요소에 대한 스크리닝의 도구로서 활용될 수 있어 조직학이나 면역학적인 기존의 방법으로 평가할 수 없는 분자생물학적 레벨의 평가 방법으로 유용할 것이라 기대된다.
본 연구과제에서는 골수유래 중간엽 줄기세포와 천연 및 인공의 대표적 지지체를 이용하여제조한 인골연골을 모델로 특성 분석을 수행하였으며, 상기한 바와 같은 각 단계의 분석법 및 그 결과는 개발자에게는 자체 제품 품질 관리를 할 수 있는 항목으로 사용될 수 있을 것이며, 심사자에게는 신청된 유사한 조직공학제제의 품질을 평가하는데 귀중한 자료로 활용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼

Tissue engineering product is defined as artificial tissue or organ which is made of autogenic, allogenic or xenogenic cells seeded and cultured on the scaffold for the regeneration of human organ and tissue. Tissue engineering product can be a substitute to the need of human tissue or organ, and it

Tissue engineering product is defined as artificial tissue or organ which is made of autogenic, allogenic or xenogenic cells seeded and cultured on the scaffold for the regeneration of human organ and tissue. Tissue engineering product can be a substitute to the need of human tissue or organ, and it may be able to cover the medical area which has no other solution with current technology. For that reason, many countries competes to develope tissue engineering products as a promising future industrial area and many products, for example, artificial skins, artificial bones and artificial cartilages are already in market. However, because it is a brand new area, scientific standards for quality, safety and efficacy are not well established yet and many countries have their own regulations. For that reason, to meet the needs of scientific standards to check quality, safety and efficacy of tissue engineering products, especially the products with multipotent stem cells, we built artificial cartilage model made of bone marrow derived mesenchymal stem cells which are seeded on the representative scaffolds, and we compared and analyzed the characteristics of those.
We identified mesenchymal stem cells with morphology test, FACS analysis for the surface markers, and differentiation test to the bone, cartilage and adipose cells. For the scaffolds, we chose gelatin as a representative of natural polymers and PLGA(poly lactic-co-glycolic acid, 75:25) as a representative of artificial polymers. With SEM(scanning electron microscope) and porosity test, gelatin was expected to produce artificial cartilage tissue better than PLGA since gelatin made interconnected structure. The pore size and porosity in the scaffolds were $170{\sim}220um$, and 80% each, good enough for the cell growth. SEM image after seeding cells on the top of scaffold showed normal attachment and growth of cells. Also, there was no difference in the viability between gelatin and PLGA, and it was inversely proportional to culture period.
H&E staining, as a histological analysis, showed that scaffolds serve as stable structure for the cell growth and differentiation. Alcian blue staining and collagen type II staining, as immunological analysis for cartilage differentiation, gave positive results for the products and it`s staining intensity was proportional to the culture periods of differentiation. Gelatin might be much better than the PLGA for the cartilage differention since it showed stronger positive staining signal than PLGA.
We also performed human whole genome microarray test, and compared RNA expression of mesenchymal stem cell before and after seeding the cells on the scaffolds. As a control, we used cultured human cartilage cells with the scaffold as a control. As results, differentiated cells of the products showed high expression level of cartilage related genes and low expression level of cell cycle and growth related genes, as a evidence of successful differentiation. And, when we compared cartilage tissue, each originated from cartilage cells and mesenchymal stem cells, we could observe similar expression pattern but somewhat lower expression level and different expression pattern in the point of whole genome. This kind of analysis may be very useful molecular biological tool for the verification of specific gene, and can be used as a screening tool for targeted gene searching.
In this study, we analyzed characterization analysis of artificial cartilage model of made from bone marrow derived mesenchymal stem cells with natural and artificial scaffolds. As we described above, each analytical tools and results can be used as a good quality control method for the company, and good evaluation tool for reviewers.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 자체연구사업 연구결과 보고서 ...2
• 요약문 ...4
• SUMMARY ...6
• 목차 ...8
• I. 연구개발과제 연구결과...9
• 제 1 장 연구개발과제의 개요...9
• 제 2 장 연구개발과제의 국내.외 연구개발 현황...13
• 제 3 장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과...15
• 제 4 장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...48
• 제 5 장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...51
• 제 6 장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획...52
• 제 7 장 참고문헌...54
• 제 8 장 첨부서류...55