초록 ▼

본 연구과제에서는 생분해성 및 다공성 고분자인 폴리(락타이드-co-글리콜라이드) (PLGA) 공중합체와 비분해성 고분자 폴리테트라플르오르에틸렌으로 구성된 인공혈관 지지체에 개의 골수로부터 채취한 줄기세포를 분리/배양 및 특성을 분석한 다음, 평활근세포와 줄기 세포를 이용하여 in vitro 조직공학 인공혈관을 재생하였다. in vitro 조직공학 인공혈관을 개의 경동맥에 1,3,4주 동안 이식하여 in vivo 조직공학 인공혈관으로 유도하고, 이식된 줄기세포의 생체 내 활성 및 안전성에 대한 평가를 진행하였다. 제조된 PLGA 층

본 연구과제에서는 생분해성 및 다공성 고분자인 폴리(락타이드-co-글리콜라이드) (PLGA) 공중합체와 비분해성 고분자 폴리테트라플르오르에틸렌으로 구성된 인공혈관 지지체에 개의 골수로부터 채취한 줄기세포를 분리/배양 및 특성을 분석한 다음, 평활근세포와 줄기 세포를 이용하여 in vitro 조직공학 인공혈관을 재생하였다. in vitro 조직공학 인공혈관을 개의 경동맥에 1,3,4주 동안 이식하여 in vivo 조직공학 인공혈관으로 유도하고, 이식된 줄기세포의 생체 내 활성 및 안전성에 대한 평가를 진행하였다. 제조된 PLGA 층 내부표면에 콜라겐을 코팅하여 고분자 지지체 표면을 세포부착성 표면으로 전환하였다. 또한 개의 대동맥으로부터 분리된 평활근세포를 12주 동안 in vitro 세포배양을 진행하여 media 조직을 재생하였으며, CCK-8을 사용하여 평활근세포 수의 증가를 세포배양 기간 중에 확인하였다. 재생된 in vitro 조직공학 인공혈관의 중막조직 표면에 자가 및 동종 줄기세포를 2차 배양한 다음, 2주 더 in vitro 배양함으로써, 줄기세포에 의한 intima 조직이 유도된 in vitro 조직공학 인공혈관을 제조하였다. 골수로부터 획득한 줄기세포와 media 조직에 배양된 줄기세포의 존재여부를 CD34 및 CD146 항체를 tagging 한 다음, FACS를 이용하여 분석하였다. 또한 이식된 intima 줄기세포의 in vivo 활성에 대한 평가로서, 개의 경동맥에 1-4주 동안 이식된 조직공학 인공혈관의 개통율, 혈전현상, 혈류속도/shear rate 등의 생역학적 특성을 평가한 결과, 이식기간과 줄기세포 종류에 따라 in vivo 조직공학 인공혈관의 개통율에 있어 차이점을 보여 주었다. 재생된 조직공학 인공혈된 조직 및 개 현관조직에 대한 분석으로써, 광학현미경, 디지털카메라, 전자현미경, 투과전자현미경을 사용하여 전체적인 조직의 형태부터 세포의 소기관에 이르는 다양한 조직학적 관찰을 진행함과 동시에, 항체를 이용한 이식된 줄기세포의 내피세포 전구체로의 분화 가능성 평가, $\alpha$-actin, H&E 및 Mason Trichrome 염색에 의한 조직재생여부 평가, 재생조직에서의 세포외기질(콜라겐) 형성 등을 관찰하였다. 동종 줄기세포와 평활근세포에 의하여 재생된 intima 혈관조직의 in vivo 활성보다는, 자가 줄기세포들에 의하여 재생된 intima 혈관조직의 생체 내 활성이 보다 혈관 개통율이 높기 때문에, 자가 줄기세포를 이식한 조직공학 인공현관의 생체 내 안전성이 보다 우수한 것으로 평가되었다. 측정된 shear rate 및 혈액속도 값과 같은 생역학적 데이터를 혈관개통율과의 상호관계를 유도함으로써, 이식된 조직공학 인공혈관의 생체 내 활성을 예측할 수 있는 지표로 활용가능 한 것으로 사료되었다. 또한 투과전자현미경 줄기세포 특이 염색결과는, 폐색된 조직공학 인공혈관과 개통된 조직공학 인공혈관을 구분할 수 있는 근거자료로 사용가능하기 때문에, 조직공학 인공혈관의 생체 내 활성을 평가할 수 있는 지표로 활용가능 할 것으로 사료되었다.

Abstract ▼

We evaluated in vivo activity and safety of the vascular graft tissue-engineered with both biodegradable polymeric scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in this study. Fabrication of a hybrid vascular graft was obtained by coating a biodegradable poly(lactide-co-glycolide) on both

We evaluated in vivo activity and safety of the vascular graft tissue-engineered with both biodegradable polymeric scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in this study. Fabrication of a hybrid vascular graft was obtained by coating a biodegradable poly(lactide-co-glycolide) on both sides of a non-biodegradable expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE). Canine allo-smooth muscle cells were seeded on the inside surface of the PLGA layer of the polymeric scaffolds after coating cell adhesive collagen on its luminal surface. In vitro cell culture lasted for 12-14 weeks, thus obtaining a vascular media tissues by replacing the PLGA layers. Auto- or or allo stem cells from mesenchymal stem cells of the canine bone marrow were seeded and in vitro cultured on the in vitro engineered media tissue of the graft for additional 2 weeks, thus forming an intima layer. The in vitro tissue-engineered vascular graft was implanted in the canine carotid artery for 4 weeks. While stem cells were verified by FACS analysis before stem cell seeding, media tissue regeneration by smooth muscle cells was evaluated by CCK-8. Their in vivo bioactivity was determined by measuring flow rates, thrombosis and tissue formations, which were dependent upon the graft conditions such as stem cell sources and implant periods. The explanted tissues were analyzed by immunohistology of $\alpha$-actin, H&E and Masson Trichrome. Both the canine artery and the engineered tissues of intima, media and adventitia as well as anastomosis were further characterized by SEM, TEM, light microscopy and digital camera. The results demonstrated differences in their histology, macro- and micro-scopic morphology between the patented and occluded grafts. The autologus stem cells based in vivo tissues demonstrated higher patency rates than those of the allo stem cells based ones. Structural analysis by TEM demonstrated entrapment of blood cell and formation of thrombosis in the tissues of the occluded tissue engineered graft but not in the patent one, indicating employment of In vivo evaluation index.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서...1
• 제 출 문...2
• 목 차...4
• I. 연구개발결과 요약문...5
• 연구결과보고서 요약문...5
• Summary...7
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...10
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표...10
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...11
• 1.3 국내.외 기술개발 현황...12
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...18
• 제1절 자가유래 줄기세포의 분리, 배양 및 분석...18
• 제2절. 고분자성 지지체와 자가유래 줄기세포를 이용한 in vitro 특성 연구...19
• 제3절 소구경 인공혈관 이식과 생체 내 활성 및 안전성 평가...22
• 제4절 in vivo 재생조직의 조직학적 평가...24
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...27
• 제1절 자가유래 줄기세포의 분리, 배양 및 분석...27
• 제2절 고분자성 지지체와 자가유래 줄기세포를 이용한 in vitro 특성 연구...33
• 제3절 소구경 인공혈관 이식과 생체내 활성 및 안전성 평가...44
• 제4절 In vivo 재생조직의 조직학적 평가...85
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...153
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과...155
• 5.1 활용성과...155
• 5.2 활용계획...156
• 제6장 기타 중요변경사항...157
• 제7장 참고문헌...158
• 제8장 첨부서류...163