● 국제적으로 3R (replacement, reduction, refinement) 원칙을 토대로 기존 동물실험을 통한 개발 의약품 또는 식품의 안전성 관련 독성시험을 대체하려 하고 있다. 특히 OECD에서 주도적으로 대체독성시험에 대한 개발을 추진하고 있다. 즉, 가능하면 실험동물을 이용하지 않거나 또는 사용되는 실험동물 수를 줄이거나 혹은 실험동물에 스트레스 등을 줄이는 방법을 이용하여 독성시험을 수행하려한다 (OECD, 2002a). 특히, 화장품관련 분야에서 유럽연합이 2009년부터 동물시험을 이용하여 안전성 혹은 유효성이
● 국제적으로 3R (replacement, reduction, refinement) 원칙을 토대로 기존 동물실험을 통한 개발 의약품 또는 식품의 안전성 관련 독성시험을 대체하려 하고 있다. 특히 OECD에서 주도적으로 대체독성시험에 대한 개발을 추진하고 있다. 즉, 가능하면 실험동물을 이용하지 않거나 또는 사용되는 실험동물 수를 줄이거나 혹은 실험동물에 스트레스 등을 줄이는 방법을 이용하여 독성시험을 수행하려한다 (OECD, 2002a). 특히, 화장품관련 분야에서 유럽연합이 2009년부터 동물시험을 이용하여 안전성 혹은 유효성이 검증된 화장품 또는 화장품원료의 시판을 전면 금지한다는 정책 결정에 의거, 개발시 필연적으로 피부감작시험이 수반되는 화장품분야에 있어서 대체독성시험법 개발은 유럽연합국가들 뿐만 아니라 미국, 일본 등에서 초미의 관심사가 되어 있다. ● 최근 국내에서도 실험동물의 대체에 대한 의견이 모아져 한국동물실험대체법 연구회(Korean Association for Alternatives)가 설립되었으며 여기에는 화장품업계, 의약계, 기타 연구기관과 정부 부처의 참석이 있었다. 이 연구회는 2006년 2월 한국동물실험대체법학회(Korean Society for Alternative to Animal Experiments)로 발전하여 2007년 2월 동계학술대회를 개최하는 등 활동을 전개하고 있다. 하지만 아직 시작 단계에 불과하여 국제적 흐름에 맞추어 가기 위해서는 부단한 노력이 요구되고 있는 상황이다. ● 본 연구팀에서는 지난 과제에서 확립한 시험법에 대한 검증 연구로써 inter-laboratory validation study를 수행하였다. 안점막 자극시험 대체시험법 연구 및 검증 시험(1세부과제)에서는 공동 연구를 진행하고 있는 서울대와 (주)아모레퍼시픽, 한국화학시험연구원간의 HET-CAM test와 NRU assay에 대한 검증 연구를 수행한 결과 시험의 재현성이 도출되었다. 또한 기존의 방법을 부분적으로 변형한 대체시험법을 적용하여 기존의 방법을 보완하였다. HET-CAM test의 변형 시험법인 CAM-TB 시험법을 확립하고, HET-CAM test, draize test와의 상관성 분석을 통해 시험법의 명확한 가이드라인이 도출되었다. Bovine corneal opacity assay에 대해서는 소각막 대신 돼지 각막을 사용한 porcine corneal opacity assay를 수행하여 두 시험간의 높은 상관성이 도출되었다. ● 피부감작성평가 대체시험법 중 h-CLAT 시험법 보완 및 실험실간 정도 관리(2세부과제)에서는 THP-1 cell line을 in vitro에서 배양 시 배양액에 생성되는 MIP-1beta cytoklne 수준과 CD54 및 CD86 표면항원 발현 수준에 있어서 세포 배양 시 첨가되는 피부감작성물질과 비감작성물질간 차이가 있음에 근거하여 실험을 수행한 결과 피부감작성 관련 양성물질로 dinitrofluorobenzene (DNFB), benzocaine, 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one (CMI)을 추가하는 결과가 도출되었고, 단순자극성물질로 lactic acid, isopropanol, salicylic acid 및 DMSO에 대하여 MIP-1beta cytokine 수준과 CD54 및 CD86 표면항원 발현 수준 관련 h-CLAT 시험을 수행하여 h-CLAT 시험법의 일반화 가능성 검증이라는 결과가 도출되었다. 또한 (주)아모레퍼시픽과의 실험실간 검증을 수행한 결과 양호한 일치도가 도출되었다. ● 인공피부 모델을 이용한 피부자극 대체시험법 평가(3세부관제)에서는 EPI-200 인공피부와 국내제작 모델인 $KeraSkin^{TM}$ 인공피부에 시험물질을 일정시간 처리 후 MTT와 IL-1$\alpha$를 측정하여 시험물질의 독성을 평가한 결과 $KeraSkin^{TM}$이 피부자극 대체시험법으로 적용가능함이 도출되었다. 또한 (주)아모레퍼시픽과의 실험실간 검증에서 높은 상관관계를 보이는 결과가 도출되었다.
Abstract▼
The objective of this study is the inter-laboratory validation of several alternative methods to three animal experiments (Draize eye irritation test, skin sensitizing test, and skin irritation test) and new methods such as HET-CAM TB assay, Porcine Corneal Opacity and Permeability(PCOP). Con
The objective of this study is the inter-laboratory validation of several alternative methods to three animal experiments (Draize eye irritation test, skin sensitizing test, and skin irritation test) and new methods such as HET-CAM TB assay, Porcine Corneal Opacity and Permeability(PCOP). Considerating the 3Rs (reduction, refinement, and replacement) of animal experimentation, it is very important to establish the reliable alternatives to animal test. Interlaboratory validation of alternatives for Draize eye irritation test, such as the hen's egg test-chorioallantoic membrane(HET-CAM) or Neutral Red Uptake(NRU) assay was performed. In addition, we validated PCOP assay and HET-CAM to Draize eye irritation test. They are correlated well with draize test (Pearson's correlation coefficiency>0.9). Level of macrophage inflammatory protein (MIP-1beta) produced from THP-1 monocytic leukemia cells and CD54 and/or CD86 expression expressed on THP-1 cells was increased in the presence of chemicals that have contact-sensitizing ability such as dinitrofluorobenzene (DNFB), nickel sulfate hexahydrate, benzocaine, 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one (MCI), and photassium dichromate. This experiment results done in two institutes were correlated well. For the alternative test of skin irritation test, MTT assay and IL-1$\alpha$ level were measured in the presence of chemicals in Keraskin model and EPI-200 model. The results were correlated well with previous experiment results.
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