초록 ▼

사람의 피부, 양막, 인대, 뼈, 연골, 근막, 건, 심장판막, 혈관 둥과 같은 인체조직은 심장, 간, 신장 등의 고형장기와 달리 면역학적 거부반응의 발생빈도가 상대적으로 낮으며 한 사람의 기증자로부터 불특정 다수의 수혜자에게 이식이 가능하다는 것이 특징이다. 따라서 이식을 위해 채취한 조직이 감염성 위해인자에 오염되었을 경우 그 오염이 많은 사람들에게 전파될 수 있다. 기증자의 안전성 확보를 위해 기증자의 병력을 검토하고, 기증자의 신체에 대한 육안 검사를 통해 감염의 증후, 외상 등 조직의 성상에 영향을 주는 요인의 유무를 확인

사람의 피부, 양막, 인대, 뼈, 연골, 근막, 건, 심장판막, 혈관 둥과 같은 인체조직은 심장, 간, 신장 등의 고형장기와 달리 면역학적 거부반응의 발생빈도가 상대적으로 낮으며 한 사람의 기증자로부터 불특정 다수의 수혜자에게 이식이 가능하다는 것이 특징이다. 따라서 이식을 위해 채취한 조직이 감염성 위해인자에 오염되었을 경우 그 오염이 많은 사람들에게 전파될 수 있다. 기증자의 안전성 확보를 위해 기증자의 병력을 검토하고, 기증자의 신체에 대한 육안 검사를 통해 감염의 증후, 외상 등 조직의 성상에 영향을 주는 요인의 유무를 확인하고, 또한 조직에 대한 혈액검사 및 세균학적 검사를 통해 감염질환에 대한 선별검사를 실시한다 할지라도 감염성 위해인자(바이러스, 세균, 진균)에 의한 오염의 가능성을 배제할 수 없다. 본 연구의 목표는 인체조직에 대한 안전하고 효율적인 소독방법과 멸균방법을 실험을 통하여 제시하고, 동 방법에 대한 표준모델을 확립하여, 조직은행별로 표준화되어 있지 못한 소독 및 멸균방법에 대하여 표준모델을 제시함으로써 인체조직의 안전성 확보수준을 향상시키고, 안전한 인체조직이 공급되도록 하는데 있다. 이를 위해 다음과 같은 연구를 수행하였다. 1) 미국, 유럽 등 선진국 및 국제기구의 인체조직이식재의 안전관리에 대한 관리 지침의 검토 및 분석. 2) 문헌에 나타난 선진국 사례를 중심으로 인체조직이식재 소독 및 멸균공정에서 감염성 위해인자 제거 및 불활화 방법의 효율성 검토. 3) 조직은 행에서 실시하고 있는 인체조직이식재 소독 공정(70% 에탄올 처리 공정)과 멸균 공정(감마선조사 공정과 EO 가스 공정)의 인체조직이식재(양막, 피부, 무세포진피층) 오염 가능 위해성 바이러스 및 모델 바이러스[human immunodeficiency virus(HIV), bovine herpes virus(BHV), bovine viral diarrhoea virus(BVDV), porcine parvovirus(PPV), bovine parvovirus(BPV)]에 대한 불활화 효율 검증 및 표준화. 4) 조직은행에서 실시하고 있는 인체조직이식재 소독 공정(70% 에탄올 처리 공정과 항생제 처리공정)과 멸균 공정(감마선조사 공정과 EO 가스 공정)의 biological indicator [세균(B. subtilis, E.coli) 및 진균(Candida albicans)]에 대한 불활화 효율 검증 및 표준화. 바이러스 불활화 검증 결과 모든 공정이 동일한 바이러스에 대해 동일한 불활화 효과를 나타냄을 확인하였다. 에탄올 처리 공정에서 HIV, BHV, BVDV 같은 enveloped virus는 처리 시간 2.5분안에 대부분 불활화되었지만, PPV와 BPV같은 non-enveloped virus는 에탄올에 저항성을 나타내었다. 감마선 조사 공정과 EO 가스 멸균 공정에서 대부분의 바이러스들이 검출한계 이하로 완벽하게 불활화되었다. 에탄올 처리 공정에서 E. coli와 C. albicans는 처리한 온도에 상관없이 모두 5분 안에 완벽하게 사멸하였다. 하지만 .B. subtilis는 큰 저항성을 나타내었는데, 에탄올 저항성은 B. subtilis 균주의 포자(spore) 때문에 나타난 현상으로 보인다. 항생제 처리 공정에서 E. coli와 B. subtilis는 처리 3시간안에 완벽하게 불활화되었다. 감마선 조사 공정과 EO 가스 멸균 공정에서 세균과 진균 모두 검출한계 이하로 완벽하게 불활화되었다. 에탄올 처리 공정과 감마선 조사 공정은 양막조직에 물리.화학적 변성을 야기하지 않았다. EO 가스 멸균 공정은 피부조직에 물리.화학적 변성을 야기하지 않았다. 이와 같은 연구를 통해 일반적으로 인체조직이식재의 안전성 보증을 위해 실시되고 있는 바이러스 및 세균, 진균 둥 감염성 위해인자 불활화 공정의 효과와 조직의 안정성을 검증하였다. 인체조직은행에서는 이와 같은 연구 결과를 활용하여 인체조직의 안전성 증진을 위한 인체조직 소독 및 멸균공정을 확립할 수 있을 것이다.

Abstract ▼

Human tissue transplatation, using amniotic membrane, bone, cartilage, cornea, fascia, ligament, pericardium, skin, tendon, vascular graft, heart valve, dura mater, has been increased. These human tissues can be contaminated with various infectious disease agents including HIV, HBV, HCV, as well as

Human tissue transplatation, using amniotic membrane, bone, cartilage, cornea, fascia, ligament, pericardium, skin, tendon, vascular graft, heart valve, dura mater, has been increased. These human tissues can be contaminated with various infectious disease agents including HIV, HBV, HCV, as well as bacteria, fungi, and TSE-associated prions. Therefore it should be necessary to disinfect and sterilize human tissues before transplatation. The safety of human tissue is ensured through complementary quality control measures that include donor selection, validation and implementation of effective technology for disinfection and sterilization, and monitoring of the tissue for the presence of virus, bacteria and fungi. In order to validate and standardize the methods for disinfection and sterilization of human tissues, following researches were conducted.
1) Study on the regulatory guide lines for human tissues intended to transplant. 2) Literature review for the evaluation of inactivation efficiency of viruses, bacteria, and fungi by disinfection and sterilization methods. 3) Study on the regulatory guide lines for viral validation. 4) Development of viral validation system to evaluate the efficiency of viral clearance steps for human tissues. 5) Validation of viral inactivation during 70% ethanol sterilization process, gamma irradiation process, EO gas sterilization process. 6) Validation of inactivation of bacteria and fungi during 70% ethanol sterilization process, gamma irradiation process, EO gas sterilization process. 7) Documentation and standardization of disinfection and sterilization processes. A variety of experimental model viruses including human immunodeficiency virus(HIV), bovine herpes virus(BHV), bovine viral diarrhoea virus(BVDV), porcine parvovirus(PPV), bovine parvovirus(BPV) were chosen for viral clearance validation. Enveloped viruses such as HIV, BHV, and BVDV were effectively inactivated to undetectable levels by 70% ethanol sterilization process, gamma irradiation process, and EO gas sterilization process. Also non-enveloped viruses such as BPV and PPV were effectively inactivated to undetectable levels by gamma irradiation process and EO gas sterilization process. However PPV and BPV showed high resistance to 70% ethanol sterilization process. E. coli and C. albicans were effectively inactivated to undetectable levels by 70% ethanol sterilization process, gamma irradiation process, and EO gas sterilization process. Also B. subtilis was effectively inactivated to undetectable levels by gamma irradiation process and EO gas sterilization process. However it showed high resistance to 70% ethanol sterilization process. This high resistance of B. subtilis to ethanol treatment is probably due to the endospore. All the disinfection and sterilization processes did not show any detrimental effect on tissues. Through this study, the efficiency of disinfection and sterilization methods used for human tissue intended to transplant was evaluated. These results will be useful to optimize and standardize the methods for disinfection and sterilization methods for the assurance of the safely of human tissue.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• I. 연구개발결과 요약문...8
• 연구결과보고서 요약문 ...8
• Summary ...10
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...12
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...12
• 1.1. 총괄연구개발과제의 목표...12
• 1.1.1. 연구배경...12
• 1.1.1.1. 인체조직의 정의 및 용도...12
• 1.1.1.2. 인체조직은행...12
• 1.1.1.3. 인체조직은행의 조직 안전관리 프로그램...13
• 1.1.1.4. 인체조직 소독 및 멸균방법...16
• 1.1.1.5. 소독(disinfection)의 정의 및 방법...17
• 1.1.1.6. 멸균(sterilization)의 정의 및 방법...19
• 1.1.1.7. 조직이식재의 바이러스 안전성...23
• 1.1.1.8. 인체조직 소독 및 멸균방법 표준모델 확립 연구의 중요성...25
• 1.1.2. 연구의 목적 및 범위...27
• 1.2. 총괄연구개발과제의 목표달성도...29
• 1.3. 국내.외 기술개발 현황...32
• 1.3.1. 국외 연구동향...32
• 1.3.2. 국내연구동향...32
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...34
• 2.1. 자료수집...34
• 2.2. 미국, 유럽 등 선진국 및 국제기구의 인체조직이식재의 안전관리에 대한 관리 지침의 검토 및 분석...35
• 2.3. 문헌에 나타난 선진국 사례를 중심으로 인체조직이식재 소독 및 멸균공정에서 감염성 위해인자 제거 및 불활화 방법의 효율성 검토...35
• 2.4. 조직은행에서 실시하고 있는 인체조직이식재 소독 및 멸균 공정의 바이러스에 대한 불활화 효율 검증...35
• 2.4.1. 바이러스 안전성 검증에 사용되는 바이러스 선택...36
• 2.4.2. 바이러스 불활화 검증 procedure...37
• 2.4.3. 공정 시료의 cytotoxicity와 interference test...38
• 2.4.4. Scale-down 제조공정에 바이러스 spiking...38
• 2.4.5. 공정 시료의 바이러스 정량 분석...38
• 2.4.6. 검증 실험 결과의 해석...39
• 2.4.7. 검증 결과의 해석을 위한 고려 사항...39
• 2.4.8. 바이러스 배양...40
• 2.4.9. 감염역가 시험법에 의한 바이러스의 정량...41
• 2.4.10. 소독공정 : 70% 에탄을 처리 공정...41
• 2.4.11. 멸균공정 : 감마선조사 공정...42
• 2.4.12. 멸균공정 : EO 가스 공정...42
• 2.5. 조직은행에서 실시하고 있는 인체조직이식재 소독 및 멸균 공정의 세균 및 곰팡이에 대한 불활화 효율 검증...43
• 2.5.1. 균주의 배양...44
• 2.5.2. 70% 에탄을 처리 공정(소독공정)에서 세균 및 진균 불활화 효율 검증 및 최적화...44
• 2.5.3. 항생제 처리 공정(소독공정)에서 세균 및 진균 불활화 효율 검증 및 최적화...44
• 2.5.4. 감마선조사 공정(멸균공정)에서 세균 및 진균 불활화 효율 검증 및 표준화...44
• 2.5.5. EO 가스 공정(멸균공정)에서 세균 및 진균 불활화 효율 검증 및 표준화...45
• 2.6. 70% Ethanol 처리 공정이 조직의 안정성에 미치는 영향...46
• 2.6.1. H.E staining(Hematoxylin & Eosin staining)...46
• 2.6.2. M.T staining(Masson Trichrome staining)...46
• 2.6.3. hEGF(human epidermal growth factor) 정량분석...46
• 2.6.4. 아미노산 함량 분석...46
• 2.7. 감마선 조사 처리 공정이 조직의 안정성에 미치는 영향...47
• 2.7.1 IR(Infrared spectroscopy) 분석...47
• 2.7.2. DSC(Differential scanning calorimeter) 분석...47
• 2.7.3. Collagenase 분해도 비교...47
• 2.7.4. hEGF(human epidermal growth factor) 정량분석...47
• 2.8. EO 가스 처리 공정이 조직의 안정성에 미치는 영향...48
• 2.8.1. Hematoxylin & Eosin Stain 조직 염색 관찰...48
• 2.8.2. 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope) 관찰...48
• 2.8.3. 투과전자현미경(TEM) 관찰...48
• 2.8.4. Collagen I dot blot 관찰...48
• 2.9. 조직은행과 식약청에 관련 기술 이전...49
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...50
• 3.1. 70% Ethanol 처리 공정에서 바이러스 불활화...50
• 3.1.1. 70% Ethanol 처리 공정에서 HIV 불활화...50
• 3.1.2. 70% Ethanol 처리 공정에서 BHV 불활화...50
• 3.1.3. 70% Ethanol 처리 공정에서 BVDV 불활화...51
• 3.1.4. 70% Ethanol 처리 공정에서 PPV 불활화...51
• 3.1.5. 70% Ethanol 처리 공정에서 BPV 불활화...52
• 3.2. 감마선 조사 처리 공정에서 바이러스 불활화...64
• 3.2.1. 감마선 조사 공정에서 HIV 불활화...64
• 3.2.2. 감마선 조사 공정에서 BHV 불활화...64
• 3.2.3. 감마선 조사 공정에서 BVDV 불활화...65
• 3.2.4. 감마선 조사 공정에서 PPV 불활화...66
• 3.2.5. 감마선 조사 공정에서 BPV 불활화...66
• 3.3. EO gas 처리 공정에서 바이러스 불활화...76
• 3.3.1. EO gas 처리 공정 중 HIV 불활화...76
• 3.3.2. EO gas 처리 공정 중 BHV 불활화...76
• 3.3.3. EO gas 처리 공정 중 BVDV 불활화...77
• 3.3.4. EO gas 처리 공정 중 PPV 불활화...78
• 3.3.5. EO gas 처리 공정 중 BPV 불활화...79
• 3.4. 70% Ethanol 처리 공정에서 세균 및 진균 불활화...90
• 3.5. 항생제 처리 공정에서 세균 및 진균 불활화...95
• 3.6. 감마선 조사 공정에서 세균 및 진균 불활화...98
• 3.7. EO gas 처리 공정에서 세균 및 진균 불활화...102
• 3.8. 70% Ethanol 처리 공정이 조직의 안정성에 미치는 영향...105
• 3.8.1. H.E staining(Hematoxylin & Eosin staining) 시험...105
• 3.8.2. M.T staining(Masson Trichrome staining)...105
• 3.8.3. hEGF(human epidermal growth factor) 정량분석...106
• 3.8.4. 아미노산 함량 분석...106
• 3.9. 감마선 조사 처리 공정이 조직의 안정성에 미치는 영향...108
• 3.9.1. IR(Infrared spectroscopy) 분석...108
• 3.9.2. DSC(Differential scanning calorimeter) 분석...108
• 3.9.3. Collagenase 분해도 비교...109
• 3.9.4. hEGF(human epidermal growth factor) 정량분석...110
• 3.10. EO 가스 처리 공정이 조직의 안정성에 미치는 영향...111
• 3.10.1. H.S staining(Hematoxylin & Eosin staining) 시험...111
• 3.10.2. Verhoeff Van Geison Stain 시험...111
• 3.10.3. 전자현미경 구조...112
• 3.10.4. DSC(Differential scanning calorimeter) 분석...113
• 3.10.5. Collagen I Dot-blot 시험...114
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...115
• 4.1. 고찰 및 결론...115
• 4.2. 피부 소독 및 멸균방법 표준 모델...122
• 4.2.1. 서론...122
• 4.2.2. 감염성 위해인자 소독 및 멸균 공정...124
• 4 2.3. 바이러스 불활화 검증...126
• 4.3. 양막 소독 및 멸균방법 표준 모델...130
• 4.3.1. 서론...130
• 4.3.2. 감염성 위해인자 소독 및 멸균 공정...132
• 4.3.3. 바이러스 불활화 검증...134
• 4.4. 인체조직 소독 및 멸균방법 가이드라인 제정을 위한 제안...138
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과...140
• 5.1. 활용성과...140
• 5.2. 활용계획...141
• 제6장 기타 중요변경사항...142
• 제7장 참고문헌...143
• 제8장 첨부서류...145
• 총괄 연구과제 요약...146
• 붙임 1. 방법서 : EO 가스 (산화에틸렌 가스) 멸균 공정 ...148
• 붙임 2. 방법서 : 감마선 조사 멸균 공정 ...157
• 붙임 3. 방법서 : 인체조직 소독을 위한 70% 에탄올 처리 공정 ...160