$CuCl_2$
● 본 연구는 독성물질 작용기전 연구를 통한 간독성평가 기반 구축과 독성물질 국가 관리를 위한 기술개발과 보급 및 국내독성 인프라 육성을 위해 간독성물질의 독성작용기전을 연구 및 간독성 유발 물질의 스크리닝 방법을 확립하고자 하였음.
● 간독성유발물질의 독성작용기전 연구: - 대사활성화가 필요하지 않은 독성물질의 간독성 작용 기전 연구: 독성물질의 직접적 독성 유발에 있어서 활성산소종 (ROS)에 의해서 간세포의 독성을 유발하는지 알아보기 위해 간독성 물질인 $H_2O_2$와 $CuCl_2$를 처리하여 ROS 생성 및 간세포독성의 세포손상지표인 세포생존력(MTT assay)과 LDH leakage를 측정한 결과 $H_2O_2$와 $CuCl_2$에 의해서 HepG2 human hepatoma cell의 간세포독성과 ROS의 양이 증가하였음.
- 대사활성이 요구되는 독성물질의 간독성 작용기전 연구: 3-MC(3-methylcholanthrene: CYP1A1 유도제) 및 pyridine(CYP2E1 유도제) 처리에 의해 CYP1A1, CYP2E1 발현과 효소 활성이 증가하였으며, butylated hydroxytoluene(BHT), acetaminophen(APAP), thiabendazole(TBZ), nitrosodimethylamine(NMDA) 처리에 의해 glutathione S-transferase(GST)와 NAD(P)H: quinone oxidoreductase(NQO1) 단백질 발현이 증가하였으며, 3-MC 및 pyridine 와 동시처리 하였을 때 GST와 NQO1 단백질 발현이 더욱 증가하였음. 간 독성 유발 물질인 AFB1, FB1, TBZ, BHT 등에 대한 간독성 작용기전 연구로 이들 물질이 DNA adduct 형성에 미치는 영향을 조사한 결과 AFB1에 의해서 DNA adduct 가 증가하였음.
- 간장 내 면역관련 세포 활성화를 이용한 간실질세포의 간독성 작용기전 연구: 간장 내 면역 활성을 유도하는 lipopolysaccharide(LPS), concanavalin A(Con A), fumonisin B1(FB1), APAP 대한 간세포독성 기전을 연구하기 위해서 면역관련 세포인(macrophages) 또는 임파구세포(T-cells)와 간실질세포(HepG2)와의 공동 배양 후 LPS, ConA, FB1, APAP를 처리하여 간세포 손상을 유도하는 염증성 싸이토카인인 tumor necrosis factor-alpha(TNF-$\alpha$), Interferon-gamma(IFN-$\gamma$), Interleukin-6(IL-6) 유전자 발현 및 이들 싸이토카인의 발현을 조절하는 전사조절인자인 nuclear factor (NF)-kappaB($NF-{\kappa}B$), activating protein-1(AP-1)활성을 확인한 결과 TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$ 발현은 증가하였으나, IL-6의 발현은 증가하지 않았음. 또한 간독성 물질에 의해 NF-${\kappa}B$ 활성은 증가하였으나 AP-1 활성은 증가하지 않았음. 공동배양에서 HepG2/T-cell 또는 HepG2/macrophages 공동배양 시 HepG2의 단독 배양 보다 TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$ 발현 및 간독성 물질에 의해 NF-${\kappa}B$ 활성이 더욱 증가하였음. TNF-$\gamma$ 중화 항체가 간독성 물질에 대한 독성에 미치는 영향 확인한 결과, 간독성 물질에 의해 증가한 세포독성 (LDH leakage, MTT assay, 세포 형태, caspase assay, TUNEL)이 TNF-$\alpha$ 중화항체에 의해서 독성이 감소하였음. 위의 결과는 LPS, ConA, FB1, APAP와 같은 간 독성 물질에 의해서 싸이토카인의 발현을 조절하는 전사조절인자인 NF-${\kappa}B$의 활성화를 유도하여 TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$의 발현을 유도하였으며, 증가한 염증성 싸이토카인은 간실질세포의 간독성을 유발하였음. 위의결과로 간독성물질(LPS, Con A)은 간실질세포인 HepG2 세포에 직접 독성 작용을 유도하지 않고 간비실질세포인 macrophages나 면역세포인 T-cell의 활성화를 유도하여 간손상을 일으키는 것으로 사료됨. 본 연구에서 확립한 공동배양 조건은 독성물질의 독성 유발에 있어서 간실질세포와 면역관련세포와의 상호 연관성 및 독성 유발 작용기전 연구에 활용 할 수 있을 것으로 사료됨.
● 간독성 유발물질의 스크리닝 방법 제안. - 대사활성화가 필요하지 않은 독성물질의 간독성연구: ROS를 소거하는 물질로 잘 알려진 N-acetyl cysteine(NAC)을 전 처리 한 후 독성물질에 대한 간세포 간독성평가 (MTT assay, LDH leakage 측정) 한 결과 ROS를 소거하는 물질인 NAC에 의해서 간독성 유발 물질인 $H_2O_2$ 와 중금속인 $CuCl_2$에 의한 세포 독성아 감소하였음. 위의 결과는 $H_2O_2$와 중금속인 $CuCl_2$에 의한 간세포 독성 유발에 있어서 ROS가 중요하게 관여함을 알 수 있음. 위의 연구로 MTT assay, LDH leakage 및 ROS 측정방법은 간독성 유발물질의 스크리닝 방법으로 활용할 수 있을 것으로 사료됨.
- 대사활성이 요구되는 독성물질의 간독성 연구: 정상적인 상태와 3-MC-유도형 CYP1A1, pyridine-유도형 CYP2E1에 대한 간독성물질의 독성을 평가 (CYP1A1, CYP2E1 효소의 발현 및 효소활성도 측정과 세포 독성지표인 MTT assay, LDH leakage를 측정) 한 결과 3-MC (CYP1A1 유도제) 처리에 의해 CYP1A1 발현과 효소 활성이 증가 하였으며, AFB1, BHT, TBZ에 대한 독성은 3-MC와 동시 처리 하였을 독성이 더욱 증가하였나, APAP, NMDA 증가하지 않았음. pyridine 처리에 의해 CYP2E1 발현과 효소 활성이 증가 하였으며, APAP, NMDA에 대한 독성은 pyridine과 동시 처리하였을 독성이 더욱 증가하였으나, AFB1, BHT, TBZ는 증가하지 않았음. 위의 연구 방법은 간독성 물질의 대사에 관여하는 대사효소의 특이성을 증명 할 수 있는 간독성 물질의 스크리닝 방법으로 활용할 수 있음.
- 간장내 면역세포의 활성화를 이용한 간 실질세포의 독성작용 연구: 간조직에서 면역 활성을 유도하는 LPS, ConA, FB1, APAP 대한 간세포독성 작용 연구하기 위해서 면역관련 세포인 (macrophages) 또는 임파구세포(T-cells)와 간실질세포(HepG2)와의 공동배양 후 LPS, ConA, FB1, APAP 처리에 대한 TNF-$\alpha$, IFN-${\gamma}$, IL-6의 생성 양 및 세포독성 (LDH leakage, MTT assay, 세포형태, caspase assay, TUNEL)을 측정한 결과 TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$ 생성양은 증가하였으나, IL-6 의 생성양은 증가하지 않았음. 또한 HepG2 단독배양과 HepG2/T-cell 또는 HepG2/macrophages 공동배양에 대한 독성물질의 TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$ 생성과 독성 정도를 비교한 결과 공동배양 조건에서 독성이 TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$ 생성 양 및 독성정도가 증가하였음. 위의 결과는 LPS, ConA, FB1, APAP와 같은 간 독성 물질이 T-cell 또는 macrophages를 활성화 시켜 염증성 싸이토카인의 생성을 증가 시켰으며, 증가한 염증성 싸이토카인은 간세포의 독성을 유발하였음. 본 연구에서 확립한 HepG2/T-cell 또는 HepG2/macrophages 공동배양 조건은 독성물질이 독성을 유발할 때 간비실질세포인 면역관련 세포의 활성화를 유도하여 간실질세포의 독성을 유발하는지를 증명할 수 있는 in vitro 독성 유발 물질의 스크리닝 방법으로 활용할 수 있음. 본 연구에서 선정한 TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$, IL-6 생성 양 측정 및 세포독성 측정 방법은(LDH leakage, MTT assay, 세포 형태, caspase assay, TUNEL) 독성 유발 물질의 독성을 평가 할 수 있는 지표로 활용 할 수 있음.
● 독성 유발과정에서 대사활성화 스크리닝 제안: -3-MC에 의한 CYP1A1의 발현 유도와 CYP2E1 대사효소의 발현이 유도된 형질전환 간세포에서 간독성 유발 물질의 처리에 따른 간독성을 평가 : 3-MC에 의해서 CYP1A1 발현을 유도 시킨 후 간독성 유발 물질인 AFB1, BHT, APAP, TBZ, NMDA, Fumonisin B1 (FB1) 등을 처리하여 세포 독성 지표인 생존력 (MTT assay)와 LDH leakage를 측정하여 간독성을 평가 한 결과, 3-MC에 의한 CYP1A1 발현을 유도한 경우 유도하지 않은 경우에 비해 AFB1, BHT, TBZ에 대한 독성이 증가하였으나 APAP, FB1, NMDA은 독성이 증가하지는 않았음. 이는 각각의 독성물질을 대사 시키는 효소의 특이성이 다르기 때문임. AFB1, BHT, TBZ 같은 독성 물질은 CYP1 게열 대사효소에 의해서 대사되어 독성을 유발하는데 3-MC에 의해서 CYP1 계열의 대사효소의 활성화룰 유도해 AFB1, BHT, TBZ의 대사가 더욱더 활성화 되어 세포독성이 더 증가한 것으로 생각됨. 그러나 APAP, FB1, NMDA 는 CYP2E1에 의해서 대사 되는 물질로 알려져 있기 때문에 3-MC 처리에 의해서 독성이 증가하지는 않았음. CYP2E1 대사효소의 발현이 유도된 형질전환 간세포에서 간독성 유발 물질의 처리에 따른 간독성을 평가하였음. 본 실험을 위해 렌티바이러스 유래 hCYP2E1 발현 plasmids를 제작하였으며, 이를 HepG2 세포에 감염시켜, CYP2E1 과발현세포주를 확립하였음. CYP2E1의 발현을 유도하지 않은 세포와 CYP2E1의 발현을 유도시킨 세포에서 간독성 유발 물질인 NMDA, Isoniazid (INH), APAP의 처리에 따른 간독성을 생존력(MTT assay)와 LDH leakage를 측정 및 광학 현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰하였음. 실험 결과 CYP2E1의 단백질의 발현이 유도시킨 세포주에서 NMDA, INH, APAP에 의한 세포독성이 CYP2E1을 유도하지 않은 세포주보다 더욱 민감하였음. 본 연구에서 확립한 CYP2E1 과발현세포주를 활용하여 간독성 유발과정에서 대사활성화를 수반하는 독성물질의 스크리닝 방법으로 활용 할 수 있음.
- 간 microsome을 이용한 독성물질의 간독성 유발과정에서 대사활성화 스크리닝: CYP1A1 및 CYP2E1의 발현을 유도하는 beta-naphthoflavone ($\beta$-NF)와 pyridine을 동물에 처리하고 간 microsome을 분리하였음. 분리한 microsome에 간독성을 유발하는 물질인 AFB1, BHT, APAP, TBZ, NMDA, FB1를 처리 한 후 세포독성을 측정 하였으며, 또한 CYP1A (alpha-naphthoflavone)와 CYP2E1 (diethyldithiocarbamate: DEDC)의 효소 활성을 저해하는 저해제 처리에 따른 간독성 물질의 독성 영향을 평가하였음. 실험결과 CYP1A 및 CYP2E1 유도제를 투여 한 쥐의 간에서 분리한 microsome과 간독성 유발 물질인 FB1, TBZ, BHT, AFB1, APAP, TBZ, NMD를 동시에 처리하였을 때 간독성이 증가하였으며, CYP1A 와 CYP2E1 저해제를 처리하였을 때 증가한 독성이 감소하였음.
Abstract
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● This study was focused on the development of molecular biological methods for evaluating the liver immune system of liver toxic compounds, such as butylated hydroxytoluene (BHT), acetaminophen (APAP), thiabendazole (TBZ), nitrosodimethylamine (NMDA), lipopolysaccharide (LPS), concanavalin A (Con A
● This study was focused on the development of molecular biological methods for evaluating the liver immune system of liver toxic compounds, such as butylated hydroxytoluene (BHT), acetaminophen (APAP), thiabendazole (TBZ), nitrosodimethylamine (NMDA), lipopolysaccharide (LPS), concanavalin A (Con A), fumonisin B1(FB1), Isoniazid (INH).
● Study of toxic mechanism on liver toxic compound: - Non metabolic toxic compound: $H_2O_2$ and $CuCl_2$ induced production of ROS and liver cell toxicity using the LDH assay in human hematoma HepG2 cells. - Metabolic toxic compound: 3-MC and pyrindine induced enzyme activity and gene expression of CYP1A1 and CYP2E1. BHT, APAP, TBZ and NMDA induced gene expression of glutathione S-transferase (GST) and NAD(P)H: quinone oxidoreductase (NQO1). BHT, APAP, TBZ and NMDA induced gene expression of NGO1 on cotreatment of 3-MC or pyrindine. In addition to, AFB1, FB1, TBZ and BHT induced DMBA-DNA adduct in HepG2 cells. - Related liver immune system: lipopolysaccharide (LPS), concanavalin A (Con A), fumonisin Bl(FB1) and APAP induced production of inflammatory cytokine, such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-$\alpha$) and Interferon-gamma (IFN-$\gamma$) in macrophage or T cells and HepG2 cells coculture system. Also LPS, Con A, FB1 and APAP induces transactivation of NF-kB in macrophage or T cells and HepG2 cells coculture system.
● Present of screening method on liver toxic mechanism. - Non metabolic toxic compound: MTT assay, LDH and ROS method present screening method on liver toxic mechanism. - Metabolic toxic compound: Also, MTT assay, LDH and ROS method present screening method on liver toxic mechanism. - Related liver immune system: MTT assay, LDH, cell formation, caspase assay and TUNEL method present screening method on liver toxic mechanism in macrophage or T cells and HepG2 cells coculture system.
● Present of screening method on metabolic activation: - AFB1, BHT and TBZ induced metabolic activation such as CYP1A1 expression on cotreatment of 3-MC. APAP, FB1 and NMDA were not affect metabolic activation such as CYP1A1 expression on cotreatment of 3-MC because these metabolited CYP2E1. - Test of live toxic compound on CYP2E1 overexpressed HepG2: We establishment of CYP2E1 transformed HepG2 using the lentivirus. NMDA, INH and APAP induced cell toxicity in CYP2E1 overexpressed HepG2 cells than normal HepG2 cells. Therefore, we using the CYP2E1 overexpressed HepG2 cells present screening method on liver toxic mechanism. - Metabolic screening of metabolic activation using the liver microsome: We separate liver microsome that its treated beta-naphthoflavone ($\beta$-NF) and pyridine, CYP1A1 and CYP2E1 inducer FB1, TBZ, BHT, AFB1, APAP, TBZ and NMD induced cell toxicity on cotreatment of microsome in HepG2 cells.
● Quantitative analysis for liver toxicity of toxic compounds could be possible from the assessment of in vitro experiments such as, MTT assay, LDH, cell formation, caspase assay, TUNEL method 3nd CYP2E1 overexpressed HepG2 cells.
목차 Contents
- 용역연구사업 연구결과보고서...1
- 표지...2
- 제출문 ...4
- 목차 ...5
- I. 연구개발결과 요약문...6
- 연구결과보고서 요약문...6
- Summary...9
- II. 총괄연구개발과제 연구결과...11
- 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...11
- 1.1 총괄연구개발과제의 목표...11
- 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...17
- 1.3 국내.외 기술개발 현황...17
- 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...21
- 2.1. 연구내용...21
- 2.2 연구방법...26
- 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...29
- 3.1. 간독성유발물질의 독성작용기전 연구...29
- 3.2. 간독성 유발물질의 스크리닝 방법 제안...53
- 3.3. 독성 유발과정에서 대사활성화 스크리닝 제안...79
- 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...90
- 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과...93
- 5.1 활용성과...93
- 5.2 활용계획...94
- 제6장 중요변경사항...95
- 제7장 참고문헌...97
- 제8장 첨부서류...100
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