초록 ▼

1. Synaptosome에서의 ERM 단백질 신호전달 연구: Crude synaptosome에는 ERM단백질이 모두 존재하였으며 crude synaptosome에 탈분극을 유도하면 인산화 Moesin이 막분획에서 이반되었다. Synaptosome내 ERM의 역할을 규명하기 위하여 crude synaptosome을 정제한 결과, 대뇌피질, 해마, 소뇌부의 synaptic vesicle, synaptic junction에서 ERM이 존재하였다. 그러나 분리한 시냅토좀을 KCl에 의해 탈분극 시킨 경우, crude synaptosome

1. Synaptosome에서의 ERM 단백질 신호전달 연구: Crude synaptosome에는 ERM단백질이 모두 존재하였으며 crude synaptosome에 탈분극을 유도하면 인산화 Moesin이 막분획에서 이반되었다. Synaptosome내 ERM의 역할을 규명하기 위하여 crude synaptosome을 정제한 결과, 대뇌피질, 해마, 소뇌부의 synaptic vesicle, synaptic junction에서 ERM이 존재하였다. 그러나 분리한 시냅토좀을 KCl에 의해 탈분극 시킨 경우, crude synaptosome에서와 달리 ERM의 탈인산화가 유도되는 것을 확인하였다. 1차 배양세포에서도 비슷한 결과를 얻었다.
2. 뇌 조직에서 ERM 단백질과의 결합단백질 동정: 정제한 synaptosome에 폭넓게 분포하는 Ezrin을 대상으로 N말단 절반과 C말단 절반을 GST-fusion 단백질로 제조하여 pull down assay를 시행한 후 결합한 단백질을 MALDI-TOF/TOF, nanoLC tandem mass spectrometry를 이용하여 폭넓은 스크리닝을 수행하였고, Ezrin을 정제한 후 단백질 칩을 이용하여 수 많은 단백질을 동정하였다.
3. 신경세포 일차배양 및 ERM 단백질 기능 연구: 흰 쥐 소뇌와 해마에서 신경세포 1차배양법을 확립하였고, 해마 천엽배양법을 확립하였다. 1차배양 해마세포에서 글루탐산에 의해 유도되는 ERM 단백질의 인산화 기전 연구를 통해, moesin이 synaptic modulation에 관여한다는 결론을 얻었다. 한편, ERM중 moesin의 인산화 과정을 탐색하기 위하여 PC12세포를 NGF로 분화유도한 경우 Akt가 Moesin을 인산화시킴을 발견하였다.

Abstract ▼

1. ERM proteins in synaptosome: In the crude synaptosome, ERM proteins were existed and were phosphorylated and then translocated to plasma membrane by depolarization. When purified synaptosomes were depolarized, ERM proteins were unexpectedly dephosphorylated. The other hand, glutamate did not indu

1. ERM proteins in synaptosome: In the crude synaptosome, ERM proteins were existed and were phosphorylated and then translocated to plasma membrane by depolarization. When purified synaptosomes were depolarized, ERM proteins were unexpectedly dephosphorylated. The other hand, glutamate did not induce the significant increase in phosphorylated ERM proteins in isolated synaptosomes from tissue or cultured cells.
2. To identify the putative binding partner of ERM proteins in the rat brain: MALDI-TOF/TOF and nanoLC tandem mass spectrometry experiment were peformed for identifying the protein after GST pull-down assay. Furthermore, Invitrogen`s ProtoArrayTM Human Protein Microarrays was used for this object.
3. Investigating the ERM proteins in neuron: The culture methods of hippocampal and cerebellum cells were established and primary cultured hippocampal cells were applied for investigation the glutamate-induced phosphorylation of ERM proteins. In this study, ERM proteins were regulated by calcium-dependent PKC and moesin is involved in synaptic modulation. On the other hand, we showed that Akt directly phosphorylate Thr558 of moesin in PC12 cells by NGF.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 보고서 초록...3
• 요약문...4
• SUMMARY...6
• CONTENTS...8
• 목차...10
• 제 1 장 연구개발과제의 개요...12
• -연구개발의 목적...12
• -연구개발의 필요성...12
• -연구개발의 범위...12
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...14
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...15
• -시냅토좀에서의 ERM 단백질 신호전달 연구...15
• 1. 연구방법...15
• 가. 시냅토좀의 분리...15
• (1)뇌 조직에서 시냅토좀의 분리...15
• (2)1차배양 신경세포에서 시냅토좀의 분리...15
• 나. western blot...15
• 2. 연구내용 및 결과12...16
• 가. 시냅토좀 분리에 의한 뇌 조직에서의 ERM 단백질의 분포...16
• 나. 인산화 ERM 단백질의 세포내 전위(translocation) 연구...16
• 다. 시냅토좀의 자극에 의한 ERM 단백질의 인산화 변화...16
• -뇌에서의 ERM 단백질과 결합하는 단백질의 동정...21
• 1. 연구방법...21
• 가. GST-pulldown assay...21
• 나. Nano LC tandom mass spectrometry...22
• 다. Protein chip assay...22
• 2. 연구내용 및 결과...22
• 가. GST-pulldown assay...22
• 나. Nano LC tandom mass spectrometry...23
• 다. Protein chip assay...24
• -신경세포에서 ERM 단백질의 활성화 조절기전 연구...28
• 1. 연구방법...28
• 가. 신경 세포의 1차배양...28
• 나. 면역염색...28
• 다. FM4-64 흡입 실험...28
• 2. 연구내용 및 결과...29
• 가. 글루탐산에 의한 ERM 단백질의 인산화 경로 연구...29
• (1) 글루탐산에 의한 일시적이고 재빠른 ERM 단백질의 인산화...29
• (2) 1차배양된 해마세포에서 칼슘 신호 의존적인 ERM 단백질의 인산화...31
• (가) AMPA, NMDA, DHPG에 의한 ERM 단백질의 인산화...31
• (나) 신경세포에서 칼슘의존적인 PKC에 의한 ERM 단백질의 인산화...31
• 나. 신경세포에서 ERM 단백질의 분포...36
• (1) 분화과정에 따른 ERM 단백질의 분포...36
• (2) moesin의 axonal localization...38
• 다. moesin의 발현이 억제된 세포에서 글루탐산에 의한 boutons 수의 변화...38
• 라. PC12에서 ERM 단백질의 인산화 기전 연구...41
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...43
• -연도별 연구목표 및 평가착안점...43
• -연도별 연구개발목표의 달성도...44
• -관련분야의 기술발전에의 기여도...45
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...49
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...50
• 제 7 장 참고문헌...51