초록 ▼

폴리케타이드 화합물 중 임상에서 사용 중인 산업적으로 중요한 rapamycin의 생산성 향상과 새로운 유도체 창출을 위하여 rapamycin 생합성 유전자를 확보하고, 미생물의 대사산물의 구조적 다양성을 유도할 수 있는 tailoring 다변화 효소인 hydroxylase를 토양 DNA의 metagnome로부터 발굴하여 기질 적용 특성을 확인하고 또한 미생물의 metabolome library로부터 항비만 당뇨 등의 의약활성이 기대되는 단백질 탈인산화 저해물질을 발굴하는 연구를 시도하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
면역억제제로

폴리케타이드 화합물 중 임상에서 사용 중인 산업적으로 중요한 rapamycin의 생산성 향상과 새로운 유도체 창출을 위하여 rapamycin 생합성 유전자를 확보하고, 미생물의 대사산물의 구조적 다양성을 유도할 수 있는 tailoring 다변화 효소인 hydroxylase를 토양 DNA의 metagnome로부터 발굴하여 기질 적용 특성을 확인하고 또한 미생물의 metabolome library로부터 항비만 당뇨 등의 의약활성이 기대되는 단백질 탈인산화 저해물질을 발굴하는 연구를 시도하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
면역억제제로 사용 중인 rapamycin 생산 균주인 Streptomyces hygroscopicus의 genomic library에서 rapamycin 생합성 유전자와 조절유전자 및 전구체 합성에 관련된 유전자들를 클로닝하고 기능을 분석하였다. 그리고 유전자 조작이 어려운 S. hygroscopicus에서 외래 유전자 도입 방법을 수립하고 S. hygroscopicus에서 조절유전자 및 전구체 대사 유전자 집단을 도입하여 rapamycin 생산성을 증진하였다. 체계적으로 rapamycin 생산 균주의 metabolome 분석을 통하여 limiting 요소를 진단하고 부족한 유전자 및 조절유전자를 과 발현하여 성공적으로 생산성 향상을 이루었다. 대사산물의 생합성시와 구조적 다양성을 유도할 수 있는 tailoring 다변화 효소인 hydroxylase 중 기질유연성이 기대되는 P450 BM3 type hydroxylase의 신규 유전자로 난 배양성의 근권 미생물 유래로 생각되는 syK181를 토양 DNA의 metagnome로부터 성공적으로 확보하여 발현시키고 효소특성을 확인하였다. 또한 항비만 당뇨 활성이 기대되는 PTP1B 저해활성을 갖는 토양미생물 분리주 FG00675를 선정하고 이 균주로부터 분자량 690과 704, 분자식은 $C_{36}H_{50}O_{13}$ 및 $C_{37}H_{52}O_{13}$의 3 가지 신규물질 675-A, B 와 C를 분리하고 구조를 규명함으로써 미생물의 2차대사산물의 다양성에 기인한 유용 의약활성의 선도물질을 발굴할 수 있는 기술수준과 구조를 분석할 수 있는 경쟁력을 입증 할 수 있었다.

Abstract ▼

1. Cloning of rapamycin biosynthetic gene cluster and improvement of rapamycin production yield.
we aimed to identify the rapamycin biosynthetic gene cluster and analyze its biosynthetic routes, as well as improve rapamycin producer into industrial strain and generate rapamycin analogues. Besides

1. Cloning of rapamycin biosynthetic gene cluster and improvement of rapamycin production yield.
we aimed to identify the rapamycin biosynthetic gene cluster and analyze its biosynthetic routes, as well as improve rapamycin producer into industrial strain and generate rapamycin analogues. Besides, a successful studies on the genetic maniupulation in S. hygroscopicus have never been reported, which also has made us improve rapamycin producer into industrial strain by conventional method, not by advanced approaches such as genetic and metabolic engineering.
2. Cloning of tectronic acid biosynthetic gene cluster
Tectronic acid biosynthetic gene cluster will be cloned from the genomic library of Micromonospra sp. M91 strain isolated from soil.
3. Isolation of hydroxylase gene from metagenome library and enzymatic characterization through protein expression
The gene of bifunctional P450 hydroxylase(BM3 type P450) characterized as substrate flexible hydroxylase could be isolated through PCR screening method. The selected genes will be analyzed by sequencing of DNA for BM3 type P450 hydroxylase genes, expressed as an active form in E. coli and finally the expressed protein will be evaluated with enzyme characterization.
4. Screening of the inhibitors on PTPase from soil microorganism and metabolome library
For the screening of pharmaceutical metabolites from microorganisms, Actinomycetes and fungi have been isolated from soil and the isolated strains have been cultivated. The solvent extracts of cultured broth and mycellium have been prepared. The extracts will be assayed for the inhibitory activity against PTP1B and the candidate strains selected. From the cultured broth of selected candidate microorganisms, the inhibitory compounds would be isolated as a pure compound and the chemical structures of isolated inhibitors would be determined. The inhibitory activities of isolated compounds on various protein phosphatases, DSPase, PTPase and PPase, would be evaluated and compared.

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과제의 개요...26
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...34
• 제 1 절 외국의 경우...34
• 제 2 절 국내의 경우...37
• 제 3 장 연구개발 수행내용 및 결과...40
• 1 절 Rapamycin 생합성 유전자군의 확보와 생산성 증진...40
• 1-1. Rapamycin 생합성 유전자군의 클로닝...40
• 1-2. Rapamycin 생산성 증진...47
• 1-3. Rapamycin 유도체의 생합성...56
• 2 절 Tectronic acid 생합성 유전자군의 확보...59
• 2-1. Micromonospora sp. M97의 genomic library 구축...60
• 2-2. Tectronic acid 생합성 전구체의 분석...61
• 2-3. Tectronic acid 생합성 유전자군의 클로닝...62
• 3 절 메타게놈에서 hydroxylase 유전자의 발굴과 발현...66
• 3-1. BM3 P450 hydroxylase 유전자의 발굴...66
• 3-2. Hydroxylase 유전자의 발현과 효소활성 분석...68
• 4 절 미생물 배양산물에서 PTPase 저해물질 발굴...70
• 4-1. 미생물분리주 배양액의 PTPase 저해활성 검정...70
• 4-2. 곰팡이 분리주로부터 활성물질의 분리정제...70
• 제 4 장 목표 달성도 및 관련분야에의 기여도...76
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...84
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...88
• 제 7 장 참고문헌...94