초록 ▼

1. 인간배아줄기세포의 단일세포 배양기술의 개발
인간 배아줄기세포는 최소 30~50개 정도의 세포군 상태에서만 colony formation이 유지되는 것으로 알려져 있음. Guided differentiation이나 genetic modification 등과 같은 연구 및 세포동결보존의 효율을 높이기 위해서는 단일세포 배양기술의 개발은 필수적인 사항임. 따라서 본 과제에서는 인간 배아줄기세포를 대상으로 Trypsin-EDTA 또는 Ca, Mg free-PBS 처리에 의해 단세포상태로 분리된 hES cell을 human fee

1. 인간배아줄기세포의 단일세포 배양기술의 개발
인간 배아줄기세포는 최소 30~50개 정도의 세포군 상태에서만 colony formation이 유지되는 것으로 알려져 있음. Guided differentiation이나 genetic modification 등과 같은 연구 및 세포동결보존의 효율을 높이기 위해서는 단일세포 배양기술의 개발은 필수적인 사항임. 따라서 본 과제에서는 인간 배아줄기세포를 대상으로 Trypsin-EDTA 또는 Ca, Mg free-PBS 처리에 의해 단세포상태로 분리된 hES cell을 human feeder cell 또는 ECM matrix 상에 plating 하여 colony formation이 가능한 세포로 순응시킴. 이미 선행연구를 통하여 단일세포 배양기술의 기본 기술은 개발완료가 된 상황이었으며 이를 발전시켜 일상적으로 활용 가능한 단일세포 배양기술과 동결보존기술을 개발하였음.
2. Viral vector system을 이용한 유전자 변형 줄기세포주의 확립
본 연구실은 일본 RIKEN 연구소와 공동으로 인간 배아줄기세포에 외래 유전자를 도입할 수 있는 Retro virus 및 Lenti virus vector system을 확립하였고 mouse와 monky ES cell에 대한 예비실험을 완료한 상태임. 따라서 기 확립된 viral vector system을 이용하여 외래유전자가 도입된 hES subcell line을 개발하고자 시도하였음. 이를 위해 CMV, hEF1$\alpha$, Chicken $\beta$-actin promotor 등을 이용한 promotor assay와 reporter gene인 EGFP를 도입한 hES cell line을 구축하고자 하였으며 이를 바탕으로 최적의 viral vector system을 이용하여 분화관련 master 유전자를 cloning 하여 이를 이용한 특정유전자 도입 hES sub cell line을 구축하였음. 확립된 유전자 변형 hES cell에 대해서는 hES cell 고유의 특성유지 여부와 특정 유전자 도입 hES과 naive hES와의 분화유도를 비교 분석하여 분화효율의 차이등을 비교분석하였음.
3. 인간배아줄기세포로부터 중배엽성 세포로의 분화유도 및 생체내 기능 회복 기술개발
인간배아줄기세포로 부터 중배엽성 세포로의 분화유도 기술을 개발하기 위해 크게 3가지의 측면을 고려하여 연구개발하였음. 첫째, 다양한 분화 유도물질군을 확보로 본 연구에서 분화유도하기 위한 혈관내피세포, 근골격계세포 및 혈액세포 분화발생과정에 관여하는 다양한 화학물질, 호르몬 및 성장촉진인자 등에 대한 후보물질을 발굴하고 이들 물질에 대한 분화유도 효과등을 분석하였음. 둘째, 분화유도환경의 조절을 통한 분화유도기술을 검토하였음. 특히 줄기세포의 분열 및 분화과정에서의 hypoxy-condition의 효과, cell cycle 조절을 통한 분화유도 등을 조사하였음. 셋째, 다양한 기질세포와의 공동배양을 통한 분화조절을 탐색하였음. 특정 분화조직으로의 물질을 분비하는 것으로 알려진 다양한 기질세포 (stromal cell line)를 이용하여 줄기세포와의 공동배양을 통한 분화유도 여부를 검토하였음. 이러한 세가지 연구결과를 종합하여 최종적으로 가장 효과적 분화유도 기법을 확립한다.
또한 중배엽성 세포로의 분화유도된 세포군에 대한 특성분석을 위해 RT-PCR analysis, Immunocytochemistry, Western blotting을 실시하였으며 분화유도된 줄기세포의 순수분리를 위해서는 FACS를 통해 순수분리하며 이를 체외증식을 통해 생체내 이식을 위한 세포로 활용하고자 하였음.
최종적으로 분화유도된 세포의 생체내 기능회복여부를 확인하기 위해 심혈관질환, 골다공모델, 혈액질환 모델동물을 확립하고 이에 대해 세포이식 후 생체내 기능회복여부에 대한 조사를 실시하므로서 줄기세포 이식에 따른 안전성 및 유효성평가를 실시하였음.
본 과제가 제3차년도부터 정책지정과제로 변경됨에 따라 본 연구분야 중에서 가장 가능성이 있을 것으로 판단되는 인간혈관내피세포로의 분화유도와 생체기능성 회복연구를 3차년도부터 시행하며 다른 중배엽성 세포로의 분화유도 기술개발은 생략하기로 하였음.
4. Thermo-reversible hydrogel과 nano particle 지지체를 이용한 서방형 줄기세포 유지배양 및 분화유도기술 개발
기존의 2차원적 배양체계인 줄기세포 유지배양 기술을 생체내 환경과 유사한 3차원적 조건의 배양기법을 개발하기 위하여 thermo-reversible hydrogel과 nano-particle을 결합한 지지체에 줄기세포 자가재생산 및 전분화능 유지 인자인 bFGF를 혼합한 지지체를 제작한 다음 인간 배아줄기세포 또는 성체조직 유래 줄기세포를 3차원 배양할 수 있는 조건을 개발하였음. 줄기세포를 배양함에 따라 지지체내에 혼합된 bFGF가 서서히 방출됨으로서 줄기세포의 유지배양이 가능하게 유도하였으며 이러한 system은 줄기세포 분화유도 인자를 bFGF와 대체할 경우 특정세포로의 분화유도 여부를 조사하였음. 1개 또는 2개 이상의 분화유도물질을 분비할 수 있는 서방형 형태의 지지체를 개발하고 이를 이용한 in vitro 실험과 nude mice를 이용한 생체내 분화유도 기법을 조사하였음.
5. 기 확립된 인간배아줄기세포의 특성규명 및 정보의 공개
현재 본 연구기관에서 확립된 총 12종의 인간배아줄기세포주 중에서 유지배양이 양호하고 분화능이 확인된 10종의 세포주에 대해 정밀한 특성 분석을 실시함과 동시에 이러한 정보를 세포응용연구사업단에서 구축할 세포주 홈페이지에 공개하여 연구자들의 연구활성화에 기여할 수 있게 진행하였음. 또한 본 연구개발을 통해 얻어진 특정유전자 발현 인간배아 줄기세포주에 대한 정보와 세포주 분양도 시행하였음.
6. 인간배아줄기세포주의 교육훈련 프로그램 운영과 세포주 분양
년중 지속적인 인간배아줄기세포주의 교육훈련 프로그램을 개발하며 특히 초급과정부터 분화유도에 이르는 고급과정으로 분리하여 교육훈련 프로그램의 효과를 극대화시키도록 노력하였음. 또한 연구자들에게 충분한 양과 연구에 적합 세포주를 공급하도록 하며 필요시 연구자들이 요구하는 미분화 또는 분화중인 인간배아줄기세포의 DNA 등의 분양도 시행하였음.
7. 인체유래의 인간지지세포 및 단백질원의 개발과 이를 이용한 임상적용 수준의 인간배아줄기세포주 확립
다양한 인체조직 세포를 기증받아 일차로 기 확립된 인간배아줄기세포주의 유지배양에 대한 효능성 평가를 시행하여 가장 양호한 지지세포를 선발하며 또한 상업화 진행중인 인체유래의 단백질원 대체제 또는 인체 혈액 유래의 대체 단백질원에 대한 인간배아줄기세포 유지배양을 위한 효능평가를 시행하였음. 이 연구를 통해 얻어진 지지세포와 대체단백질원을 이용하여 기관보유의 GMP 시설하에서 기증받은 인간배아를 이용하여 임상적용 수준의 인간배아줄기세포주 1종을 확립하였음.

Abstract ▼

Theses research was undertaken to develop the novel techniques such as human tissue originated feeder cells and new protein sources for establishment and stable maintenance of human embryonic stem cells in vitro. In addition, we are develop to novel technologies related differentiation into specific

Theses research was undertaken to develop the novel techniques such as human tissue originated feeder cells and new protein sources for establishment and stable maintenance of human embryonic stem cells in vitro. In addition, we are develop to novel technologies related differentiation into specific cell lineages such as osteoblast and endothelial cell from human embryonic stem cells and confirmed the competence of their functionality after transplantation in disease animal models. From these results, we are obtain the outcomes as follows;
1. We are successfully established the 1 putative clinical grade human ES cell lines which was undertaken the characterization.
2. We are carried out to distribute and train the human embryonic stem cell lines in Korean scientists.
3. We are develop the safe and effective cell maintain technologies and cryopreservation methods for human embryonic stem cells.
4. We are develop the novel technologies of highly purified and functional cell differentiation, especially osteoblast and endothelial cell, from human embryonic stem cells and confirm the functionality after transplantation in disease animal models.
5. Finally we are published and registered and penned 21 papers and 7 patents

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 보고서 초록...3
• 요약문...4
• SUMMARY...8
• 목차...10
• 제 1 장 연구개발과제의 개요...11
• 제1절 연구목표...11
• 제2절 연구의 필요성...11
• 제3절 연구의 범위...14
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...15
• 제1절 국외연구동향...15
• 제2절 국내연구동향...17
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...19
• 제1절 연구방법...19
• 제2절 연구내용...19
• 제3절 연구결과...23
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...37
• 제1절 연구개발목표의 달성도...37
• 제2절 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가...38
• 제3절 정량적 연구성과...39
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...52
• 1. 기술적 측면...52
• 2. 경제ㆍ산업적 측면...52
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...53
• 제 7 장 참고문헌...53