초록 ▼

현재 비타민 C는 대부분 화학합성에 의해 생산되고 있으나 시장성장에 따른 생산 증대를 위해 화학공정의 신규시설은 규모의 경제에 도닥하기 위하여 초기투자비가 많이 늘뿐아 아니라 현재의 청정공정수준에 맞추기 위한 추가 부담으로 생산원가가 생물전환에 비해 높아진다. 화학합성을 대체하는 기술로써의 기존의 생물전환방법이나 대사공학적 방법의 가장 큰 문제점은 산화적 대사과정을 갖는 미생물은 반드시 세포내에 중간산물이나 최종산물을 assimilation하는 대사 경로도 같이 갖는다는 것이다. 기존에 밝혀진 대사경로를 단순히 차단함으로서 부산물의

현재 비타민 C는 대부분 화학합성에 의해 생산되고 있으나 시장성장에 따른 생산 증대를 위해 화학공정의 신규시설은 규모의 경제에 도닥하기 위하여 초기투자비가 많이 늘뿐아 아니라 현재의 청정공정수준에 맞추기 위한 추가 부담으로 생산원가가 생물전환에 비해 높아진다. 화학합성을 대체하는 기술로써의 기존의 생물전환방법이나 대사공학적 방법의 가장 큰 문제점은 산화적 대사과정을 갖는 미생물은 반드시 세포내에 중간산물이나 최종산물을 assimilation하는 대사 경로도 같이 갖는다는 것이다. 기존에 밝혀진 대사경로를 단순히 차단함으로서 부산물의 생성을 막을 수는 있으나 미생물의 성장이나 원할한 대사과정의 운영에는 많은 문제점을 야기하게 된다. 따라서 가장 확실한 전락중의 하나는 관련 대사경로 유전자를 클로닝하여 유전자를 분석하고 궁극적으로 대사경로가 없는 대장균같은 숙주내에 발현시킴으로서 고효율, 고생산성 그리고 부산물이 없는 재조합 균주의 개발이 필요하다. 본 연구에서 대사전화 관련 유전자를 한개의 시스템으로 구성하여 glucose고부터 2KLG로의 전환을 시도하였다. 또한 세계 최초로 E.coll의 ketogluconate대사과정과 관련 유전자를 밝힘으로서 숙주세표로 E.coll을 사용하는데 발생할 수 있는 문제점을 해결하였다. 따라서 궁극적으로 glucose 경로 대사관련 효소 유전자가 모두 확보될 경우 성장속도가 빠르고 발효공정이 잘 확립된 대장균에서 높은 수율로 부산물 없이 비타민 C 전구체인 2KLG를 생각할 수 있을 것으로 예상된다.
본 연구를 통해 대사공학 기술과 균주육종 기술로 세계적으로 경쟁 가능한 비타민 C 생물전환공정을 개발하였으며 그 연구 결과를 유수 학술지 계제하고 특허를 출원하였다. 솔비틀 경로뿐만 아니라 포도당 경로의 생물전환 기술을 확보하였으며 솔비톨 결오의 생물전환 기술의 일부를 세계적 생물공학 전문기업인 미국의 ADM사에 40만불 규모의 기술용역 및 이전을 하였다.

Abstract ▼

The importance of L-ascorbic acid (Vitamin C) in human health care was established soon after its discovery and cause tremendous interest in all aspects of its scientific and industrial development. At present, Vitamin C is mainly produced by a modification of the Reichsten-Grussner systhesis, first

The importance of L-ascorbic acid (Vitamin C) in human health care was established soon after its discovery and cause tremendous interest in all aspects of its scientific and industrial development. At present, Vitamin C is mainly produced by a modification of the Reichsten-Grussner systhesis, first developed in 1934. This process is a somewhat lengthy and capital-intensive route. Micobial conversion of several chemical substances deserves special attention, mainly due to its economical and ecological advantages as compared to conventional chemical routes. One approach is to acheve increased production of 2-keto-L-gulonate (2KLG), an intermediate in the production of Vitamin C. 2KLG can be easily converted to Vitamin C through acid or base catalyzed cyclization.
A number of species of a group of microorganisms, Erwina, Acetobacter, and Bluconobacter, can produce 2/5-diketo-D-gluconate from D-glucose through a three-step enzymatic oxidation by glucose, gluconate, and 2-keto-D-gluconate dehydorhenase. The coryneform group of microorganisms is capable of converting 25DKG to 2KLG. The tandem fermentation process of appropriate micoorganisms to produce 2KLS was simplified by combining the relevant traits of both Erwinia sp. and Corynebacterium sp. in a single organism. 2KLS can also be synthesized from L-sorbose. Many microorganisms have an ability to convert L-sorbose to 2KLF through a two-step enzymatic oxidation by sorbose and sorbosone dehydorgenase. A few genera of microorganisms are capable of oxidizing sobitol to sorbose. Util now, many micobial conversions have been tried by using the glucose and sorbose pathwat described aboce. Nertheless, since the micoorganisms hagin the glucose and sorbose pathway also have ketogluconate metabolism, the intermediates are matebolized and the by-products are produced.
The present work effects improvements in the process for converting a commonly available metabolite such as glucose or sorbitol into 2KLG, a stable storable precursor for ascorbic acid using metabolic engineering. Our work is based in part on the novel and unexpected indentification of metabolic pathway involoves in the carbohydrate metabolism of ordinary metabolite, such as glucose to 2KLG in E. coli. To achieve our goal, a menbrane-bound gluconate dehydrogenase gene dluster, a menbrane-bound 2KDG dehydrogenase hene cluster, and 25DKG reductase have been cloned and expressed in E. Coli. The metabolic pathway involved in ketogluconate metabolism in E. coll has also been indentified and their related genes have been isolate. A process for the efficient bioconversion of an ordinary mirobial metabolite such as glucose into 2KLG by fermentation with a single reconbinant E. coli has been tried. in the sorbose patway system, we cloned a membrane-bound sorbitol dehydrogense gene, which opened the possibility of constructing a recombinant strain capable of conversion of sorbitol 2KLG in one-step.
In this work, we demonstrate that metabolic engineering based on the recombinant DNA techmology can be use to create new metabolic pathways by recruiting metabolic genes from dissimilar microorganisms into a single recombinant organism. During the course of our work, we have identified a novel ketogluconate metabolism in E. coli. This finding shoudl lead to further improement in the overall process through the use of metabolic patyway were also screened from soil. In the downstream process, the bioconversion and purification on piolt scale have been established.

목차 Contents

• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 13
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 15
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 19
• 제1절 포도당 경로의 bioconversion 유전자 관련 연구 ... 19
• 제2절 Ketogluconate 대사 관련 연구 ... 107
• 제3절 재조합 대장균을 이용한 glucose로부터 2KDG로의 생물전환 ... 162
• 제4절 재조합 대장균에의한 포도당으로부터 2KLG의 생산 ... 173
• 제5절 비타민 C 정제 및 제제화 ... 184
• 제6절 Vitamin C fatty acid 생물전환공정의 개발 ... 196
• 제7절 Ketogluconate 과생산균의 대사 분석 ... 204
• 제4장 목표 달성도 및 대외기여도 ... 222
• 제5장 연구개발 결과의 활용계획 ... 224
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술 정보 ... 225
• 제7장 참고문헌 ... 237