초록 ▼

NFAT(Nuclear factor of activated T cells)은 세포질에 존재하는 단백질로서, 인산화 효소
에 의해 활성화되면 탈인산화 되어 핵으로 들어가, 면역세포들에서 면역반응의 유도와 조절에
중요한 역할을 하는 전사조절인자이다. 그러나 지나친 NFAT의 활성화는 자가면역. 장기이식거 부반응 및 염증과 같은 면역질환을 야기 시킨다. 그러므로 면역질환을 치료하기 위해서는 NFAT전사인자의 활성화에 대한 조절이 필요하다. 현재 임상에서 항염증제 또는 면역억제제로 사용되는cyclosporin A 및 FK 506

NFAT(Nuclear factor of activated T cells)은 세포질에 존재하는 단백질로서, 인산화 효소
에 의해 활성화되면 탈인산화 되어 핵으로 들어가, 면역세포들에서 면역반응의 유도와 조절에
중요한 역할을 하는 전사조절인자이다. 그러나 지나친 NFAT의 활성화는 자가면역. 장기이식거 부반응 및 염증과 같은 면역질환을 야기 시킨다. 그러므로 면역질환을 치료하기 위해서는 NFAT전사인자의 활성화에 대한 조절이 필요하다. 현재 임상에서 항염증제 또는 면역억제제로 사용되는cyclosporin A 및 FK 506는 신장, 신경 및 위장 등에 부작용을 유발하므로, 부작용을
최소화 할 수 있는 안전한 약제 개발이 요구 되어왔다. 따라서 한방과 민간에서 오랜 기간 동
안 사용되어, 안정성 측면이 확보되고 저분자로 구성 되어 있어 신약을 개발하는데 유용한 자
원이 될 수 천연물을 대상으로, 전사인자 NFAT을 조절하는 활성물질을 선발하여 부작용이 없
는 우수한 염증치료제 및 면역억제제를 개발하고자 하였다.
NFAT dependent transcriptional reporter gene, pCMVSEAP을 함유한 Jurkat T cell line및
시료는 phenol red를 첨가하지 않은 RPMI 1640 완충액으로 희석하였다. NFAT 세포를 활성화
하기 위한 stimulator로서, phobol 12-myristate 13-acetate 와 ionomycin를 조제하였고,
P-Nitro-phenylphosphate는 SEAP 완충액에 녹여 기질로 사용하였다. 다수의 천연물 시료로부
터 활성성분은 각종 column 및 기기를 이용하여 분리하였고, 합성한 유도체와 함께 전사인자
NFAT에 대한 저해활성을 변형된 SEAP assay법에 의해 측정하였다. 즉, 시료 및 stimulator
각 50 ㎕는 세포 100 ㎕와 함께 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 반응물울 원심분
리한 후 100 ㎕ 상등액은 65 ℃에서 1시간 동안 가열하였다. 가열 후 각 50 ㎕의 SEAP
buffer와 기질을 첨가 하여 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여,
대조군에 대한 저해율로 전사인자 NFAT에 대한 저해활성을 나타냈다.
다수의 MeOH추출물의 전사조절인자 NFAT에 대한 저해활성을 탐색하여, 천궁, 벌개미취, 뇨뇨
통, 까마귀밥여름나무, 오미자, 섬오가피 및 삽주등을 선정하여 활성물질을 분리하여 전사조절
인자 NFAT의 저해활성을 연구하였다. 천궁에서 falcarindiol, 벌개미취에서 gymnasterkoreayne
G, gymnasterkoreayne B 및 gymnasterkoreayne F 및 삽주에서 acetylatractylodinol등
Polyacetylene 구조가 높은 저해 활성을 보였다. 오미자로부터 분리한 dibenzocyclooctene구조를
갖는 schisandrin A, schisandrol A, schisandrol B , schisandrin C , gomisin N , gomisin E
및 benzoylisogomisin O 의 lignan도 우수한 활성을 보였다. 그러나 섬오가피는 diarylbutane
구조의 lignan보다 kaurane type인 diterpenoid (16αH,17-isovaleryloxy-ent-kauran-19-oic
acid)의 활성이 높았다. 뇨뇨통도 oleanane triterpenoid (3α
-Acetoxy-25-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid)가 우수한 활성을 보였으며, 그 외 까마귀밥
여름나무에서 분리한 신규물질인
threo-(7S,8R)-1-(4-hydroxyphenyl)-2-[4-(E)-propenylphenoxy]-propan-1-ol도 높은 활성을
보였다. 이상의 결과로 dibenzocyclooctene구조를 갖는 lignan, kaurane type인 diterpenoid,
C-25번 위치의 oxy methylen group과 C-3위치에 acetoxyl group을 갖는 oleanane
triterpenoid 및 polyacetylenic compound가 전사인자 NFAT의 저해활성에 크게 기여하는 것으로
판단되므로 향후 전사인자 NFAT의 과도한 활성화로 야기되는 면역질환을 치료하기 위한 NFAT
전사인자의 조절제로의 개발이 기대된다.

Abstract ▼

NFAT (nuclear factor of activated T cells) is a cytoplasmic protein and is
dephosphorylated by the Ca2+ activated phosphatase and then migrates to the nucleus
to induce transcription of genes required for immune response. Activation of NFAT
normally plays a significant role in inducing immu

NFAT (nuclear factor of activated T cells) is a cytoplasmic protein and is
dephosphorylated by the Ca2+ activated phosphatase and then migrates to the nucleus
to induce transcription of genes required for immune response. Activation of NFAT
normally plays a significant role in inducing immune response. However, excessive
activation provokes immunopathological reactions. Antiinflammatory and
immunosuppressive agents (cyclosporin A and FK 506) have a lot of side effects which
were observed with the clinical use of both of these compounds. Thus, the development
of immunosuppressive agents with the potential for improved efficacy and reduced side effects has been required. Up to now, there has been no report on NFAT transcription
factor regulators from natural products. Natural products have been used as traditional
medicines or folk medicines. Therefore, natural products with good safty and low
molecular weight would be more useful candidates to lead compounds for drug
development. Thus, we tried to find bioactive compounds from various natural products
using system regulating NFAT transcription factor.
The Jurkat T cell line containing an NFAT dependent transcriptional reporter gene, pCMV
SEAP and samples were diluted in RPMI 1640 without phenol red. PMA and ionomycin
as a stimulator were dissolved in DMSO. P-Nitro-phenylphosphate as a substrate was
dissolved with SEAP buffer.derivatives. Bioactive constituents from various natural
products were isolated by the subsequent column chromatographic purification process
and their inhibitory activity on NFAT transcription factor was determined by the modified SEAP assay. For assay, 100 ul of cells were incubated with 50 ul of sample and 50 ul of stimulator at 37 ℃ for 18 hours. The reaction mixture was centrifuged and 100 ul of supernatant were heated at 65 C for 1 hour. The heated sample was incubated with 50
ul of SEAP buffer and 50 ul of substrate at 37 C for 4 hours. After incubation of the
reaction mixture, optical density was measured at 405 nm. Inhibitory activity on NFAT transcription factor was expressed as percent inhibition of the control.
Various natural products were screened on inhibitory activity against NFAT transcription
factor. C. officinal, G. koraiensis, L. formosana, R. fasciculatum, S. chinensis, A. koreanum and A. lance showed as the potent inhibitory activity on NFAT transcription factor. The polyacetylene compound (falcarindiol from C.officinal, acetylatractylodinol from A. lance;
gymnaster koreayne G, gymnasterkoreayne B and gymnaster koreayne from G. koraiensis) and
lignan with dibenzocyclootadiene structure (schisandrin A, schisandrol A, schisandrol B ,
schisandrin C , gomisin N , gomisin E and benzoylisogomisin O from S. chinensis)
exhibited strong activities. However, the activity of diterpenoid (16α
H,17-isovaleryloxy-kauran-ent-kauran-19-oic acid) from A. koreanum was higher than that
of lignan with diarybutane skeleton. 3α-Acetoxy-25-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid
from L. formosana and
threo-(7S,8R)-1-(4-hydroxyphenyl)-2-[4-(E)-propenylphenoxy]-propan-1-ol from R.
fasciculatum exhibited high activity. This fact suggests that lignan with dibenzocyclootadiene
structure, diterpenoid with kaurane type, oleanane triterpenoid with acetoxyl group at C-3
and oxy methylen group at C-25 and polyacetylenic compound could be useful in treating
inflammation and immune disease by modulating excessive activation of NFAT transcription
factor which provokes immunopathological reactions including autoimmunity, transplant
rejection and inflammation.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문...4
• 2. 영문요약문...5
• Ⅲ. 연구내용...6
• 1. 서론...6
• 2. 연구방법 및 이론...7
• 3. 결과 및 고찰...14
• 4. 결론...57
• 5. 인용문헌...59