초록 ▼

단일분자로 구성된 파아지의 리보핵산 중합효소는 전사의 개시와 연장단계에 있어서 3차원의 분자구조가 알려져 있으며 작용 기작에 대한 연구가 많이 수행된 단일분자로 구성된 DNA 중합효소와 구조적인 유사성을 지니고 있어서 분자수준의 작용 기작을 연구하는 측면에서는 여러 개의 분자로 이루어진 복잡한 구조의 리보핵산 중합효소에 비하여 훨씬 좋은 연구 대상이다. 하지만 지금까지 유전자 전사 기작에 관한 연구의
대부분은 대장균과 사람 세포의 핵, 효모의 핵의 리보핵산 중합에 의한 전사에 중점되어 왔다. 또한 이러한 연구들은 전사개시 기작

단일분자로 구성된 파아지의 리보핵산 중합효소는 전사의 개시와 연장단계에 있어서 3차원의 분자구조가 알려져 있으며 작용 기작에 대한 연구가 많이 수행된 단일분자로 구성된 DNA 중합효소와 구조적인 유사성을 지니고 있어서 분자수준의 작용 기작을 연구하는 측면에서는 여러 개의 분자로 이루어진 복잡한 구조의 리보핵산 중합효소에 비하여 훨씬 좋은 연구 대상이다. 하지만 지금까지 유전자 전사 기작에 관한 연구의
대부분은 대장균과 사람 세포의 핵, 효모의 핵의 리보핵산 중합에 의한 전사에 중점되어 왔다. 또한 이러한 연구들은 전사개시 기작에 중점 되고 있어서, 종결이나 연장에 관한 연구 결과는 빈약하다.
본 연구의 목적은 단일분자 중합효소가 전사 연장과 종결 단계에서 겪는 모든 미세한 기작을 밝힘으로써 중합성 연장과 종결 반응을 열역학적 및 동력학적으로 완벽하게 이해하는 데 있다. 이를 위해 중합성 반응의 연장과 종결에 관여하는 모든 구조적 요소들 사이의 상호작용을 밝히고, 하나씩 첨가될 때마다 이들이 어떻게 변화하고, 어떤 변화가 필요한 에너지를 제공하며, 어떻게 에너지가 전달되는지를 밝힐 것이다.
본 연구진은 T7 RNA 중합효소에 의한 전사의 연장단계에서 RNA와 중합효소간의 주요한 접촉부위를 밝혀내었으며 이러한 연장단계에서의 접촉은 RNA와 중합효소간
의 튼튼한 결합을 가능하게 해주어 중합효소가 빠르고 효율적인 전사 연장을 하는데 결정적인 역할을 한다. 그리고 E. coli의 rrnB operon에 존재하는 terminator를 도입하여 전사의 연장에서 종결로의 전이과정을 연구하였다. E. coli의 rrnB t1b terminator는 전형적인 사람의 prepro-parathyroid hormone (PTH) 전사종결을 따르는데 역시
종결신호 부근에 일정한 'ATCTGTT'라는 conserved sequence와 따르는 U-rich seuquence를 가진다. 우리는 두 부위의 종결신호에 다양한 돌연변이를 도입하여 종결 신호 각각이 전사의 종결에 미치는 결과를 분석하였으며 또한 연장단계와 마찬가지로
RNA와 중합효소와의 상호작용을 살펴보았다. 그리고 lysozyme에 각각 다른 민감도를 갖는 RNA 중합효소 돌연변이를 제작하여 전사의 종결과정에 돌연변이가 미치는 영향을 추적함으로써 전사의 종결 과정 분석 자료로 활용하였다. 또한 전사의 연장단계에서의 RNA와 중합효소와의 상호작용과 전사 종결신호가 전사 종결 단계로의 전이가 진행될 때 어떠한 기작으로 변화하여 전사의 종결에 영향을 미치는지를 규명하였다.
본 연구진은 중합효소를 고정화하는 기존의 전사복합체 구축기법의 단점을 보완하여 DNA를 고정화함으로써 온전한 ternary complex를 전사연장 뿐 아니라 종결에 이르기까지 효과적으로 얻을 수 있는 기법을 구축하였다. 또한 이러한 시스템을 바탕으로 전사 연장 기작에 대해 전사복합체의 세부적 구조 변화들과 그 기능들을 밝혀내었으며 전사 종결에 이르는 모델을 제시할 수 있었다. 이것은 비단 파아지 RNA 중합효소
의 경우뿐만 아니라 E. coli 및 진핵세포 중합효소들의 전사 기작 연구에 중요한 모델로 제시될 것이며 전사복합체 기작에 대한 지금까지의 이해 수준보다 훨씬 구체적인 기작을 제시하는 것이 될 것이다. 따라서 본 연구의 대상은 비록 가장 간단한 파아지의 전사 체계지만, 이 결과의 파급효과는 모든 전사기작에 적용될 모델을 제시할 것이고 다른 전사체계의 연구에서 이를 시발모델로 삼을 것이다.

Abstract ▼

Although our understanding on the mechanism of transcription initiation by
human, yeast and E. coli RNA polymerase is substantial, our knowledge of the
elongation and terminations is limited. Previous mechanism models on
transcription termination and elongation are being seriously challenge

Although our understanding on the mechanism of transcription initiation by
human, yeast and E. coli RNA polymerase is substantial, our knowledge of the
elongation and terminations is limited. Previous mechanism models on
transcription termination and elongation are being seriously challenged because of
recent unexpected experimental results unexplainable by old paradigms. The
objectives of this study are to construct the stable ternary complex and to
elucidate the contact site of RNA polymerase with nucleic acids. This results
enables to elucidate the macromolecular interactions of various complexes of
single-subunit RNA polymerases (such as phage T7 RNA polymerase) in
sub-molecular level and the movie-fashion compilation of their dynamic changes
during process of transcription.
Up to recently, our laboratory constructed the system of RNA polymerse
step-wise walking and developed the separation technology of transcription
ternary complex in specific site. Utilizing this system, we have elucidated the
contact sites of RNA polymerase with nascent RNA in elongation stage.
To examine the interaction of RNA polymerase with RNA in termination
stage, several DNA template with sequence-specific termination signal and
without sequence-specific termination signal were manufactured. We elucidated
the loss of significant -9 contact of RNA polymerase from the forth base of
conserved upstream termination signal. The mutant DNA templates without each
module of termination signal were aided the analysis of ternary complex
interaction. This experiment supports the confomational change in the step of
transition at transcription termination. As well as RNA-protein interaction,
DNA-protein interaction in transcription complex in also important clue. The
effect of mutant RNA polymerase was investigated by establishment of several
mutated RNA polymerase different from sensitivity on lysozyme.
We supposed a new model of sequence-specific termination by T7 RNA
polymerase according to sequenctial conformational change of ternary complexes.
We obtained the active ternary complexes via immobilization of template DNA
from elonation to termination stage. This unique system helps the elucidation of
conformational changes during whole transcription phase and the study of
termination model. The results of this research may suggest the dynamic model
of T7 phage transcription and offer the clue to the transcription mechanism
accomplished by multi-subunit RNA polymerase.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문...4
• 2. 영문요약문...5
• Ⅲ. 연구내용...6
• 1. 서론...6
• 2. 연구방법 및 이론...9
• 3. 결과 및 고찰...18
• 4. 결론...53
• 5. 인용문헌...56