초록 ▼

세균 세포벽 단백질부착 전이효소 sortase A 및 B를 분자표적으로 하여, Staphylococcus aureus 로부터 그 유전자들을 cloning하고 발현시켜 효소저해활성평가 system을 구축, 단백질 3차구조를 토대로 화합물을 합성 및 해양 천연물로부터 sortase저해물질을 탐색, 마우스 감염실험를통하여 감염억제제 선도물질을 3종 이상 도출하고자 하였음.
- Sortase A 및 B의 재조합단백질을 정제하여 활성검색계를 구축하고 합성화합물, 해양생물 자원 등으로부터 제조된 시료에 대해 저해활성을 탐색하고 활성을 추

세균 세포벽 단백질부착 전이효소 sortase A 및 B를 분자표적으로 하여, Staphylococcus aureus 로부터 그 유전자들을 cloning하고 발현시켜 효소저해활성평가 system을 구축, 단백질 3차구조를 토대로 화합물을 합성 및 해양 천연물로부터 sortase저해물질을 탐색, 마우스 감염실험를통하여 감염억제제 선도물질을 3종 이상 도출하고자 하였음.
- Sortase A 및 B의 재조합단백질을 정제하여 활성검색계를 구축하고 합성화합물, 해양생물 자원 등으로부터 제조된 시료에 대해 저해활성을 탐색하고 활성을 추적하였음.
- 합성화합물의 개발은 선행연구의 lead compound를 기반으로 computer modeling 및 docking study에 의하여 다양한 모핵을 가지는 물질을 설계 합성한 후, 의미 있는 모핵을 선정하여 다양한 치환체를 도입하고 구조-활성 상관관계를 파악하여 최적의 물질을 도출하였음
- 해양생물자원으로부터의 탐색된 sortase저해 활성물질은 각종 크로마토그래피 방법으로 분리정제 후 구조를 규명하였으며 순수물질의 활성을 평가하였음.
- 확보한 sortase 저해물질을 가지고 S. aureus 세포의 fibronectin 및 fibrinogen에 대한 결합능을 평가하였음.
- 마우스 감염동물모델을 이용한 in vivo 활성연구에서는 sortase 저해제를 S. aureus의 Newman (srtA+, srtB+)과 sortase mutant 균주인 SKM12 $\Delta$(srtA), SKM7 $\Delta$(srtB), SKM14 $\Delta$(srtA, srtB)를 감염시킨 mouse model에 투여하여 이들 저해제가 균의 감염에 의한 치사와 신장과 관절내로의 감염을 억제할 수 있는지 연구하였음.
- Sortase 활성검색계를 구축하였으며 solid-phase peptide synthesis 방법을 이용하여 Abz-LPETG-Dap(Dnp)-NH2 (검출 파장인 420nm) 기질을 합성하여 이용함. 합성화합물, 해양천연물, 약용식물 등으로부터 제조된 시료에 대하여 sortase 저해활성을 평가하였음.
- 국내 연안 해양생물 74종의 추출시료에 대하여 sortase저해활성을 검색한 후 활성이 우수한 Spongosorites sp.를 연구대상으로 선정하여 각종 크로마토그래피 방법으로 활성물질을 분리, 구조 규명하여 bis(indole) alkaloid 화합물 8종을 밝힘. 또한 Micronesia에서 채집된 시료 중 강한 저해활성 나타낸 해면 Aaptos aaptos로부터 물질을 분리하여 aaptamine계 화합물 4종을 밝힘. 이들 중 SP0505-B는 매우 강한 활성을 나타냄.
- S. aureus의 fibronection 및 fibrinogen에 대한 부착 억제활성 평가에서 해양생물 유래 화합물 들은 억제활성을 나타내어 그 효용성이 기대되었으며 이 중 SP0505-B 시료는 다량분리 후 감염동물모델을 in vivo 활성연구를 실시함.
- 선행연구에 (80종의 약용식물 추출물 검색) 기초하여 sortase 저해활성이 좋은 칠피 (Rhus verniciflua)로부터 활성물질을 분리하여 quercetin임을 밝히고 구조-활성 상관을 규명하여 sortase저해활성에 중요한 functional group을 밝힘.
- 단백질의 docking model을 토대로 새로운 화합물의 합성 및 최적화를 시도함. Diarylacrylonitrile계 화합물 중 활성이 우수한 (Z)-3-(2,5-dimethoxyphenyl) -2- (4-methoxyphenyl) acrylonitrile (compound 1)에 의해 다양한 치환체를 도입하여 구조-활성 상관관계를 파악하고 최적화를 시도 하였으며 compound 1보다 높은 수용성을 가지는 물질 compound 6을 확보함. Compound 1 및 6를 다량합성 후 감염동물모델을 in vivo 활성연구를 실시함.
- 마우스 감염동물모델을 이용한 sortase 활성 저해물질의 in vivo 활성연구에서는 sortase 저해제인 compound 1과 compound 6, 해양 천연물 유래의 SP0505-B 등 3가지 시료를 복강 투여하여 치사율을 모니터링 한 결과, 3가지 시료 모두에서 생존율이 현저히 증가함을 확인하였음. 신장과 관절 감염 억제 실험 역시 sortase 저해제에 의해 신장과 관절 내로의 감염이 감소됨을 확인함.
- 본 연구를 통하여 sortase 저해제가 Gram 양성 세균의 감염에 의한 신장내 염증과 관절내 염증에 있어 균의 감염을 억제함으로써 S. aureus 저해제 개발에 주요한 분자표적이 될 수 있음을 최초로 확인할 수 있었으며 특히 compound 1의 경우 저해제로의 개발 가능성을 보여주었음.

Abstract ▼

Recent extensive biological studies have shown that both SrtA and SrtB are critical virulent factors that participate in the establishment and persistence of infections. Therefore, selective inhibition of sortase has recently emerged as a promising new strategy for the development of novel antibioti

Recent extensive biological studies have shown that both SrtA and SrtB are critical virulent factors that participate in the establishment and persistence of infections. Therefore, selective inhibition of sortase has recently emerged as a promising new strategy for the development of novel antibiotics that do not kill Gram-positive pathogens, but rather eliminate their pathogenicity. We proposed our chemical/biological studies
toward the discovery of small-molecule inhibitors of sortase through the marine natural products screening and structural chemical modifications based on a lead compound from previous studies.
1. Enzyme activity of sortase was assayed by monitoring the increment of fluorescence intensity upon cleavage of synthetic peptide substrate with recombinant SrtA and B.
Sortase inhibitors were screened from marine natural products and synthetic derivatives by using this assay system.
2. Based on a lead compound from previous studies, a novel class of small-molecule sortase inhibitors were generated. The structure-activity relationship and the minimal structural requirements for potency were established through structural modifications and molecular modeling studies for the development of optimized compounds.
3. Development of sortase inhibitors from marine organisms was accomplished by bioassay-guided separation of natural products followed by structure determination
based on spectroscopic methods.
4. Compounds should inhibit sortase activity in vivo and in turn reduce fibronectin-binding protein surface display. To test this hypothesis, the bacterial cell
adhesion to fibronectin was evaluated via fibronectin-binding protein.
5. Staphylococcus aureus mutants lacking sortase fail to process and display surface proteins and are defective in the establishment of infections. Therefore, the antivirulence activity of sortase inhibitors was tested in mice that were infected with the wild-type and srtA- mutant of S. aureus.
Enzyme activity of sortase was assayed by monitoring the increment of fluorescence intensity upon cleavage of synthetic peptide substrate with recombinant SrtA and B.
Sortase inhibitors have been screened from marine natural products and synthetic derivatives by using this assay system. Development of sortase inhibitors from marine
organisms was accomplished by bioassay-guided separation of natural products followed by structure determination based on spectroscopic methods. Based on a lead compound from previous studies, a novel class of small-molecule sortase inhibitors was generated. The structure-activity relationship and the minimal structural requirements for potency was established through structural modifications and molecular modeling studies for the development of optimized compounds. A series of bis(indole) alkaloids and aaptamines were isolated from the marine sponge Spongosorites sp. and Aaptos aaptos, respectively,
and their inhibitory activities against SrtA were evaluated. We also examined the effects of naturally occurring flavonols on S. aureus sortases. Among them, SP0505-B exhibited most potent SrtA inhibitory activity in vitro. The fibronectin-binding activity data highlight
the potential of those isolated inhibitors for the treatment of S. aureus infections via inhibition of SrtA activity. The curing activity of (Z)-3-(2,5-dimethoxyphenyl)-2- (4-methoxyphenyl) acrylonitrile (compound 1), compound 6, and SP0505-B was evaluated
using an infected murine model. Compound 1 as sortase inhibitor significantly increased the survival and decreased the infection of S. aureus Newman in kidneys and joints. Compound 1 may be useful as an anti-sortase agent for therapeutics against infection caused by S. aureus.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문 ...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문 ...4
• 2. 영문요약문 ...5
• Ⅲ. 연구내용...6
• 1. 서론 ...6
• 2. 연구방법 및 이론 ...10
• 3. 결과 및 고찰 ...16
• 4. 결론 ...74
• 5. 인용문헌 ...76
• 6. 연구성과 ...78