초록 ▼

동물세포배양기술 및 프로테오믹스 기술을 이용하여 세포주의 선별과 개선, 세포배양 및 단백질 생산의 환경최적화, 무혈청배지, 생물반응기 및 스케일-업 연구 등을 수행함으로써, 산업적, 경제적 가치가 높은 고부가가치 단백질의 고효율 생산을 위한 총체적인 생물공정 기반기술을 확립한다.
세포배양용 perfusion system의 개발 및 scale-up 연구 분야 에서는 인간 B형 간염 치료 항체를 생산하 는 rCHO $CS^*$13-1.00를 깊이 필터 perfusion system을 이용하여 배양하였다. 중요한

동물세포배양기술 및 프로테오믹스 기술을 이용하여 세포주의 선별과 개선, 세포배양 및 단백질 생산의 환경최적화, 무혈청배지, 생물반응기 및 스케일-업 연구 등을 수행함으로써, 산업적, 경제적 가치가 높은 고부가가치 단백질의 고효율 생산을 위한 총체적인 생물공정 기반기술을 확립한다.
세포배양용 perfusion system의 개발 및 scale-up 연구 분야 에서는 인간 B형 간염 치료 항체를 생산하 는 rCHO $CS^*$13-1.00를 깊이 필터 perfusion system을 이용하여 배양하였다. 중요한 환경인자인 DO와 pH에 대해서 항체의 고생산성을 유도 할 수 있는 최적조건을 탐색하였다. DO 30%에서 80%로 증가할수 록 최종 항체 농도가 증가하였으며 포도당 대비 항체 수율도 증가하였으며 pH가 7.0에서 7.4로 증가함에 따라 산소 요구도 및 항체 농도는 증가하였지만 포도당 대비 항체의 수율은 낮아졌다. 깊이 필터 perfusion 배양 시스템을 통한 81일간의 장기 배양을 안정적으로 수행하였으며 배양 온도의 효과 및 최적 범위를 확인하였다. 두 단 깊이 필터 perfusion 배양 시스템을 개발 하였으며 회분식 배양 대비 재조합 항체 생산성이 50배 이상 증가하는 결과 (평균 항체 농도 174.15 mg/L, 생산속도 870 mg/d)를 얻었다. 이를 통해 기존의 perfusion 배양시스템의 단점을 개선하고 쉽게 scale-up이 가능한 공정을 개발할 수 있다.
세포배양배지의 개발 고생산성 세포배양 환경 개발 연구 분야 에서는 간단하면서 효과적인 배지 개발법 을 통해 무혈청배지를 개발 하였으며 회분식 및 perfusion 배양을 통해 상용배지를 대체하기에 충분함을 확인하였다. 회분식 배양시 최종 항체 농도 및 비항체 생산성은 각각 420.98 mg/L와 54.04 μg/106 cells/d로 상당히 높았으며 이는 상용배지에 비해 2.9배, 2.8배 향상된 것으로 성공적으로 무혈청 배지가 개발되었음을 알 수 있다. 적은 양의 배지 성분의 투여로도 세포가 뭉치는 것을 막을 수 있었고 미량의 비타민과 같은 배지내 특정성분의 강화를 통해 세포 성장 혹은 비항체 생산성이 향상됨을 알 수 있었다.
$CS^*$13-1.00 세포의 배양에서 주기적으로 배양 온도를 37 $37^{\circ}C$에서 33 $37^{\circ}C$로 이동시키는 배양 전략을 통해 누적 세포수 및 최종 항체 농도가 크게 증가하였다.
프로테오믹스 기술을 활용하여 고생산성 유도물질 또는 유도환경의 탐색 및 기전규명을 수행하는 연구
분야 에서는 33 $37^{\circ}C$와 37 $37^{\circ}C$의 온도를 주기적으로 이동하거나 세포의 배양시간을 변화시켰을 때 이러한 배양조건 하에서 일어나는 세포내 반응의 원리를 분자수준에서 이해하기 위해 2D와 MALDI-TOF를 이 용한 프로테오믹 기법으로 단백질의 발현패턴을 조사하였다. 어떤 특정조건하에서 처리한 세포로부터 추출된 단백질패턴을 기준이 되는 정상조건의 패턴과 비교하여 몇 가지 차이점을 얻어내었다. 또한 발견 한 몇 가지 표적단백질들을 제시함으로써 앞으로 그들의 기능적 연구를 수행하여 더 많은 항체를 만드 는 조건하에서 발현이 증가되는 단백질 군을 발견하게 되었는데, 해당과정에 관여하는 aldolase와 같은 대사성 효소들과 Grp94/96과 같은 분자 샤페론들이 이에 속한다. 그러나 미토콘드리아에 존재하는 세포 분열 조절자인 prohibitin의 경우에는 같은 조건하에서 발현이 감소됨을 보여 좋은 대조를 이루었다.
깊이 필터를 이용한 perfusion 배양 시스템을 이용하여 장기간 안정적인 고농도의 세포 배양을 통해 고효율의 재조합 항체 생산 공정을 개발하였으며 scale-up을 통한 산업적 적용에의 가능성도 제 시하였다. 기존의 상용 배지에 비해 세포 성장이나 항체 생산성을 향상 시킬 수 있는 배지를 간단하 면서도 효과적인 방법으로 개발하였으며 공정개발의 측면에서 비생산성을 향상시킬 수 있는 환경인 자들도 성공적으로 탐색하였다. 프로테오믹스 기술을 활용하여 세포 성장 단계 혹은 재조합 항체 생산 단계에서 발현이 증가되거나 억제되는 단백질을 밝혀내었으며 향후 공정 개발 단계에 적용할 수 있게 하였다

Abstract ▼

This research focuses on animal cell culture systems with high-productivity for economical production of high valued proteins such as therapeutic monoclonal antibody. This will be achieved with cell-line screening and adaptation for high rate production, environment optimization of cell-growth and p

This research focuses on animal cell culture systems with high-productivity for economical production of high valued proteins such as therapeutic monoclonal antibody. This will be achieved with cell-line screening and adaptation for high rate production, environment optimization of cell-growth and protein production, serum-free medium, bioreactors and scale-up study using cell culture technology and proteomics.
First, for economical production of high-valued proteins, perfusion systems for high density culture and stable scale-up systems were studied. rCHO cells of DG44 origin CS*13-1.00, expressing a chimeric antibody against the S surface antigen of Hepatitis B virus, was cultivated in single stage and two stage depth filter perfusion systems (DFPS) by varying temperature, pH and oxygen tension to see environmental conditions on recombinant antibody production. A long-term culture was carried out in a single stage depth filter for 81 days and the DFPS showed a steady production of monoclonal antibody with a concentration of 100~150mg/L. 2-stage DFPS system of 2L volume showed a production capacity of 870mg/d with 174mg/L concentration.
Second, development of serum-free medium for high productivity is necessary, so we studied the protein expression profiles induced under different temperature, pH, elicitors and inhibiting materials in medium. With a simple but significantly available strategy, a serum-free medium for a recombinant CHO cell line, CS*13-1.00, was developed for the production of recombinant antibody. Even though small amount of medium components were added to the basal medium, their inhibitory effect on cell aggregation made single-cell suspension cultures possible. Through fortification of several vitamins, final recombinant antibody concentration and specific antibody productivity were considerably enhanced. With a peculiar temperature shift strategy, which temperature was changed periodically to low level every 24 hour, culture life time was prolonged, resulting in significant increase of recombinant antibody concentration.
Third, using proteomics technology, we investigated the protein expression profile and the metabolism which is related in high-productive cell line. We searched: the optimized culture conditions for enhanced antibody production, including (i) temperature oscillation between $33^{\circ}C$ and $37^{\circ}C$ and (ii) various culture period. In order to understand the molecular basis of intracellular responses upon these culture conditions, we examined the protein expression patterns by the proteomic analysis using 2D and MALDI-Tof. The proteome profile of cells treated under certain condition was compared with those of control cells to display several differences in the level of protein expression.
We here report that some target proteins were discovered for the following functional studies. Among them, several metabolic enzymes such as aldolase involved in glycolytic pathway and molecular chaperones, such as Grp94/96, were up-regulated along with higher production of antibody. In contrast, prohibitin, a mitochondrial regulator for cell division, was consistently down-regulated in both conditions.
The optimization of cell culture condition and bioprocess development will bridge the gap between Korea and world-wide process technology. This will provide a basis for mass production technology on animal cell culture in Korea. We expect to solve the problem on engineering aspect for industrial scale animal cell culture and to gain technological superiority in bioprocessing aspects. Also we have trained research manpower of PhD level in bioprocess animal cell culture that is currently short of industrial demands and will file an international patent regarding two-stage depth filter system.

목차 Contents

• I.연구계획 요약문...3
• 국문요약문...3
• II.연구결과 요약문...4
• 국문요약문...4
• 영문요약문...5
• III.연구내용...6
• 제 1 장 연구배경 및 중요성...6
• 제 2 장 연구목표...9
• 제 3 장 연구방법 및 결과...11
• 제 1 절 세포배양용 perfusion system의 개발 및 scaleup 연구...11
• 제 2 절 세포 배양 배지의 개발 및 세포주의 선별 및 개선, 고생산성 세포배양 환경 개발 연구22...24
• 제 3 절 프로테오믹스 기술을 활용한 고생산성 유도물질 및 유도환경의 탐색34...36
• 제 4 장 결론...42
• 제 5 장 인용문헌...43