초록 ▼

양식대상 조개류의 발생배(유생)에 대한 냉동보존 기법을 개발하고자, 3종의 유용조개류의 번식주기, 비보존 및 보존 발생배의 형태 및 세포구조 조사, 희석액, 동해방지제, 냉동률, 해동률, 유생의 활성화 방법 등 일련의 연구과정을 통하여 가장 적합한 냉동보존 조건을 찾는 데에 연구목표를 두었다.

1. 생식주기 및 유생발생 조사
3종 조개류의 산란기를 파악하기 위하여 조직학적 방법에 의해 생식주기를 조사하고, 적정단계의 냉동보존용 유생을 확보하기 위하여 인공채란에 의한 유생의 발생속도를 수온조건별로 구하였다.

양식대상 조개류의 발생배(유생)에 대한 냉동보존 기법을 개발하고자, 3종의 유용조개류의 번식주기, 비보존 및 보존 발생배의 형태 및 세포구조 조사, 희석액, 동해방지제, 냉동률, 해동률, 유생의 활성화 방법 등 일련의 연구과정을 통하여 가장 적합한 냉동보존 조건을 찾는 데에 연구목표를 두었다.

1. 생식주기 및 유생발생 조사
3종 조개류의 산란기를 파악하기 위하여 조직학적 방법에 의해 생식주기를 조사하고, 적정단계의 냉동보존용 유생을 확보하기 위하여 인공채란에 의한 유생의 발생속도를 수온조건별로 구하였다.
2. 발생배의 냉장보존
실험용 발생배의 운반시 발생진행을 억제하고 활력을 유지하기 위한 적정 저온을 찾고자, 온도와 발생단계에 따른 발생배의 생존율을 조사하였다.
3. 발생배의 냉동보존
발생배의 적정 냉동보존 방법을 개발하기 위하여, ①여러 동해방지제에 대한 발생배의 내성, ②평형시간, 냉동률, Seeding(식빙, 유리화), Straw 크기, 해동률 등 각 냉동보존 단계별 적정 처리조건의 구명, ③냉동보존 및 비보존 발생배의 발생배의 형태 및 세포구조 조사, ④해동후 발생배의 생존율, ⑤해동후 발생배의 유생사육을 통한 생존력 여부 등을 조사한다.

진주조개, 참굴, 북방대합의 산란기는 각각 5-8월, 6-8월, 5-7월이었다. 진주조개, 참굴 및 북방대합의 적정 난발생수온은 각각 20-25$^{circ}C$, 15-25$^{circ}C$, 10-25$^{circ}C$였다. 발생배 의 냉동보존에서, 희석액은 진주조개 glucose, sucrose, 참굴 sucrose, 북방대합 sucrose가, 동해방지제로는 진주조개 DMSO, 참굴 ethylene glycol, 북방대합 DMSO, ethylene glycol이 적합하였으며, 발생단계별로는 진주조개 D형유생, 참굴각 유생단계, 북방대합 각정기 유생이 해동후 생존율이 높아 냉동보존에 효과적이었다. 해동후 유생의 생존율은 진주조개 D형유생 40-80$\percnt$, 참굴 D형유생 70-90$\percnt$,
북방대합 각정기 유생 100$\percnt$로 높았다. 냉동전후 유생 모두에서 섬모환이 뚜렷하게 보여, 치명적인 외형차이는 인정되지 않았다. 해동한 진주조개 D형유생에게 먹이를 주어 사육한 결과, 6-10일 생존하였으며, 각고의 일간성장량은 0.7 ${\micro}m$였다. 참굴에서는 2-3일간 생존하였으며, 각고의 일간성장은 1.3 ${\micro}m$였다. 이상의 연구성과에 따라, 조개류 3종의 산란기, 유생의 발생적온, 발생단계별 소요 시간을 파악하여, 냉동보존을 위한 적정단계를 구체적으로 밝힘으로써, 기초생물학적 자료를 얻게 되었다. 뒤이은 냉동보존 실험에서 각 종별, 발생배의 단계별 적정 희석액, 동해방지제를 구명함으로써, 해동후에 높은 생존율을 나타내는 성공적인 냉동보존 기술이 세계에서 세 번째로 개발되었다. 이를 바탕으로 앞으로의 조개류 발생배를 냉동보존하고자 하는 연구자나 사업자가 활용할 수 있도록 유생의 냉동보존 기법에 관한 매뉴얼을 작성하였다. 이로서 우량종, 토착종 및 절멸위기종의종 보존을 위한 유전자 보존 및 gene pool을 구성할 수 있는 기반이 마련되었다.
최종실험인 해동유생의 사육결과에서 각 유생이 수일간의 생존하고 다소 성장을 보임으로써 종패로까지 성장할 수 있는 가능성을 열었으며, 장기적으로는 조개류의 연중 종묘생산을 위한 새로운 연구분야가 개척될 수 있을 것으로 전망된다.

Abstract ▼

To develop cryopreservation techniques on embryos (larvae) of three bivalve species in aquaculture, this study aimed at clarifing the optimal cryopreservation conditions through the experiments of gametogenic cycle, shape and cell structure of embryo in pre- and post-preservation, diluents, cryoprot

To develop cryopreservation techniques on embryos (larvae) of three bivalve species in aquaculture, this study aimed at clarifing the optimal cryopreservation conditions through the experiments of gametogenic cycle, shape and cell structure of embryo in pre- and post-preservation, diluents, cryoprotectants, freezing and thawing rates, and rearing of post-thawed larvae etc.

To find out the spawning season in the bivalves and to collect the larvae, gametogenic cycle was investigated by the histological method and the speed of egg development to larval stage was calculated in various water temperatures.
In cold storage, survival rate of larvae in accordance with tenperature and developmental stage were investigated to obtain the optimal low temperature for larval transport.
To develop method of embryo cryopreservation, following experiments were carried; ① Tolerance of larva against cryoprotectants, ② Equilibration time, seeding, freezing and thawing rates, straw size for cryopreservation techniques, ③ Shape and cell structure of embryo in pre- and post-preservation, ④ Post-thaw survival, ⑤ Rearing of post-thawed larvae.

Spawning seasons for pearl oyster, Pacific oyster and surf clam were May to Aug., Jun. to Aug. and May to Jul., respectively. Optimal temperatures in development of three species were 20-25$^{circ}C$, 15-25$^{circ}C$ and 10-25$^{circ}C$, respectively.
In experiment of cryopreservation, optimal diluent and cryoprotectant were different from sp. to sp.; glucose and sucrose+DMSO for pearl oyster, sucrose+ethylene glycol (EG) for Pacific oyster, sucrose+DMSO and EG for surf clam. Optimal development stage was also different from sp. to sp.
Post-thaw survival rates of larvae of three species were 40-80$\percnt$, 70-90$\percnt$ and 100$\percnt$, respectively. No fatal change in shape and cell structure in both of unfrozen and post-thawed larvae was observed with SEM and TEM.
Thawed D-shaped larvae of pearl oyster and Pacific oyster were alive for 6-10 days and 2-3 days and their daily growth of shell hight was 0.8 ${\micro}m$ and 1.2 ${\micro}m$, respectively.
From above study results basic biological information such as spawning season and optimal temperature of egg development for cryopreservation techniques of bivalve larvae was obtained. The cryopreservation technique on bivalve larvae was successfully developed with the clarification of optimal diluent and cryoprotectant showing high post-thaw survival rates. Manual for the cryopreservation techniques on bivalve larvae was made and it will be utilized by researcher and aquaculturist who want to cryopreserve the larvae.
By the result of this study we could establish the gene pool for preservation of superior, indigenous or endangered bivalve species. Because the thawed larvae could be alive and growing for several days, it can be expected cryopreservation technique to practical use in hatchery production of bivalve spats for year-round seedling production in the near future.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문 ...4
• Ⅱ. 연구결과 요약문 ...5
• 1. 국문요약문 ...5
• 2. 영문요약문 ...6
• Ⅲ. 연구내용 ...7
• 1. 서 론 ...7
• (1) 연구배경 ...7
• (2) 연구의 필요성 ...7
• (3) 연구목표 ...8
• (4) 연구범위 ...8
• 2. 연구재료 및 방법 ...10
• (1) 생식주기와 유생 발생 ...10
• 1) 서식지 수온과 염분 ...10
• 2) 생식주기 ...10
• 3) 유생 발생 ...12
• (2) 저온에 대한 유생의 내성 ...13
• (3) 동해방지제에 대한 유생 내성 ...14
• 1) Dimethly sulfoxide에 대한 내성 ...14
• 2) Ethylene glycol에 대한 내성 ...14
• 3) Glycerol에 대한 내성 ...14
• 4) 1,2-propanediol에 대한 내성 ...15
• (4) 유생의 냉동과 냉동유생의 장기 보존 ...16
• 1) 냉동요인에 따른 유생의 냉동보존 ...16
• 2) 냉동유생의 장기 보존 ...17
• (5) 냉동 전후 유생의 구조 ...17
• 1) 외부형태 ...17
• 2) 내부형태 ...18
• (6) 해동후 유생사육 ...18
• (7) 통계분석 ...18
• 3. 결과 및 고찰 ...18
• (1) 생식주기와 유생 발생 ...18
• 1) 생식주기 ...18
• 2) 유생 발생 ...25
• 3) 고찰 ...27
• (2) 저온에 대한 유생의 내성 ...30
• 1) 진주조개 ...30
• 2) 참굴 ...30
• 3) 북방대합 ...30
• 4) 고찰 ...30
• (3) 동해방지제에 대한 유생 내성 ...32
• 1) Dimethly sulfoxide에 대한 내성 ...32
• 2) Ethylene glycol에 대한 내성 ...34
• 3) Glycerol에 대한 내성 ...36
• 4) 1,2-propanediol에 대한 내성 ...37
• 5) 고찰 ...40
• (4) 유생의 냉동과 냉동유생의 장기 보존 ...40
• 1) 발생단계별 해동유생의 생존율 ...40
• 2) 당류 첨가에 따른 해동유생의 생존율 ...43
• 3) 동해방지제별 해동유생의 생존율 ...45
• 4) 냉동률별 해동유생의 생존율 ...48
• 5) Straw 크기별 해동유생의 생존율 ...49
• 6) 장기간 보존한 유생의 생존율 ...51
• 7) 고찰 ...51
• (5) 냉동 전후 유생의 구조 ...53
• 1) 유생의 외부형태 ...53
• 2) 유생의 내부형태 ...55
• 3) 고찰 ...58
• (6) 해동후 유생사육 ...59
• 1) 진주조개 ...59
• 2) 참굴 ...60
• 3) 북방대합 ...61
• 4) 고찰 ...62
• 4. 결 론 ...62
• 5. 인용문헌 ...67