초록 ▼

O 연구목적:
방사선에 의해 활성화되는 세포 신호전달 체계를 연구하여 분자표적 물질을 발굴하고 이를 조절하여 세포사망을 증진시키는 새로운 방사선 민감제를 개발하고 또한 방사선에 의하여 항암효능이 증가되는 화학물질 제재를 발굴함. 이들을 효과적으로 암 조직내로 전달할 수 있는 방법을 개발함으로서 임상에서 방사선의 항암효과를 극대화 하고자함.
O 연구내용 및 방법:
제 1 세부과제: 신호전달 물질 기전연구
방사선-항암 병용요법 기전연구
리포좀/ATM inhibitor 및 항암제의 in vitro 방사선 민감도

O 연구목적:
방사선에 의해 활성화되는 세포 신호전달 체계를 연구하여 분자표적 물질을 발굴하고 이를 조절하여 세포사망을 증진시키는 새로운 방사선 민감제를 개발하고 또한 방사선에 의하여 항암효능이 증가되는 화학물질 제재를 발굴함. 이들을 효과적으로 암 조직내로 전달할 수 있는 방법을 개발함으로서 임상에서 방사선의 항암효과를 극대화 하고자함.
O 연구내용 및 방법:
제 1 세부과제: 신호전달 물질 기전연구
방사선-항암 병용요법 기전연구
리포좀/ATM inhibitor 및 항암제의 in vitro 방사선 민감도 효능 확인
Radio/Chemo sensitizing effect: 최적 농도, 투여시간 결정
Apoptosis 측정: DNA gel electrophoresis, Flow cytometry
Clonogenic Cell Survival
특이 유전자 발굴: DNA chip
제 2 세부과제: in vivo animal model: nude mouse, 이식암 모델, 방사선 민감제 투여,
방사선-항암 병용요법, 리포좀을 이용한 in vivo 약물전달 방법 연구
Tumor growth delay 측정: in situ apoptosis
투여경로에 따른 리포좀의 안정성 및 독성 검색
제 3 세부과제: 온도감응형 리포좀 제조 및 물리 특성 분석
표적지향성 ligand의 화학적 conjugation
표적 지향성(targetability) 검증
약물봉입효율측정 및 효율증대를 위한 formulation 확립
온도변화에 따른 약물 방출 pattern 연구
리포좀의 응집, 안정성(stability) 연구
O 연구결과:
1. 신기능 방사선 치료물질 발굴
방사선 조사시 활성화되는 세포내 신호전달 체계 중 가장 upstream에 위치하는 ATM kinase의 활성화 기전을 규명하였으며 이를 저해하여 암 세포의 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 caffeine, wortmannin, pentoxifylline, methylxathine을 발굴하였으며 ATM kjnase 활성화를 억제함을 확인하였다. 방사선 조사 후 일어나는 G2 arrest를 단축시키는 G2 arrest inhibitor들은 DNA damage repair를 감소시킴으로서 세포사망을 증가시킴을 확인하였으며 이들이 방사선 민감제로서의 가능성을 검증하였다.
2. 방사선민감도 관련 유전자를 이용한 새로운 방사선 치료법 개발
방사선은 NQO1 유전자를 활성화하여 NQO1의 target인 $\beta$-lapachone의 항암능력을 증가시킴을 관찰하였다. NQO1과 $\beta$-lapachone의 관계를 더 자세히 규명하기 위해 NQO1의 siRNA를 이용한 세포주를 구축하여 NQO1의 발현 및 효소활성도의 저하를 확인하였고 또 방사선-$\beta$-lapachone 처치후의 세포사망이 정상 세포주에 비하여 저하됨을 관찰하여 방사선에 의한 $\beta$-lapachone의 항암효능 증가에 NQO1이 중요한 modulator임을 확증하였다.
3. 방사선-항암제 병용요법에 의해 유도되는 새로운 유전자 발굴
$Twinchip^{TM}$ Human 8K(Digital ginomics, Seoul)을 이용하여 방사선-항암제 ($\beta$-lapachone)에 의하여 발현되는 유전자의 변화를 비교하였는데 A549 cell line에서는 336개의 유전자가 2배 이상 증가했으며 반면에 20개 유전자는 2배 이상 감소했다. 또한 RKO cell line에서는 907개의 유전자가 2배 이상 증가했으며, 반면에 269개 유전자는 2배 이상 감소했다. 증감을 보인 유전자득 중 흥미호운 유전자들에 대한 세포 생물학적 기능에 대한 연구는 계속 수행하면 새로운 암치료의 분자표적을 발굴할 수 있으리라 사료된다.
4. NQO1에 의하여 효능이 증가되는bioredutive 제재 발굴 밀 효능 검증
현재 임상에서 항암제로 많이 사용하고 있는 약제 중에 cisplatin이 NQO1의 발현과 활성도를 증가시킨다는 새로운 결과를 얻었다. 세포를 cisplatin으로 처치 후 4시간 후에 $\beta$-lapachone으로 처치하면 survival이 0.35%로 감소하여 additive 이상의 효과가 있음을 확인하였다. 이는 cisplatin과 같은 항암제가 NQO1의 발현을 증가시켜 $\beta$-lapachone의 민감도를 높인다는 흥미로운 결과이며 향후 항암제간의 병합치료에 $\beta$-Lap을 이용하면 기존에 사용하고 있는 항암제재의 용량을 줄이고 항암효과를 극대화시킬 수 있으리라 기대한다.
5. 온도감응형 리포좀을 이용한 방사선 민감제의 in vitro 및 in vivo 효능 검증
온도에 민감한 리포좀에 방사선 민감제를 봉입하여 in vitro 및 in vivo에서의 방사선 항암효과 증진을 관찰하였다. In vitro 실험에서 RKO 세포를 9 Gy 조사 후 5%의 생존율을 보였으나 3mM caffeine을 함께 투여 후에는 0.05%의 생존율을 보였다. 특히 온도 감응형 리포좀에 봉입된 caffeine을 39$^{\circ}C$에서 방사선과 함께 조사한 경우에는 세포가 $1\times10^{-3}$의 생존율을 보이는 것으로 보아 우리가 개발한 리포좀의 in vitro 효과를 입증할 수 있었다. In vivo 실험에서는 RKO (human colon adenocarcinoma) 이식암을 이용하였으며 방사선 민감제로 알려진 caffeine을 봉합한 온도민감성 리포좀을 투여하고 30분 후에 암을 42$^{\circ}C$로 30분간 가온한 다음 암을 10 Gy 방사선에 조사하여 tumor growth delay가 현저히 증가함을 관찰하였다.
6. 리포좀을 이용한 방사선 민감제의 효능연구
온도 민감형 리포좀의 최적 formualtion을 확립하였고 DPPC:DMPC:DSPC (4:1:1 molar ratio) 리포좀에 25%의 봉입효율로 caffeine을 봉입하여 무균조건에서 만들어 이들의 방사선 민감도 증진제 및 항암제의 in vitro, in vivo에서 방사선 민감도 효능을 확인하였다. 방사선 민감제로 알려진 caffeine을 봉합한 온도민감성 리포좀을 투여하고 30분 후에 암을 42$^{\circ}C$로 30분간 가온한 다음 암을 10 Gy 방사선에 조사하여 tumor growth delay가 현저히 증가함을 관찰하였다. 또한 온도민감형 리포좀의 암표적지향을 높이기 위하여 EGFR (epidermal growth factor receptor)에 선택적으로 결합하는 단클론항체인 anti-EGFR antibody를 공유결합시키고 이들의 in vitro 및 in vivo에서의 암세포 표적능력을 검증하는 연구를 수행하였다.

Abstract ▼

Specific Aims.
The overall purpose of this study was to develop means to improve the response of cancer to radiotherapy. To this end, we designed the study with three major specific aims. The Specific Aim 1 was to conduct in vitro studies with two major purposes: (i) find upstream molecular signa

Specific Aims.
The overall purpose of this study was to develop means to improve the response of cancer to radiotherapy. To this end, we designed the study with three major specific aims. The Specific Aim 1 was to conduct in vitro studies with two major purposes: (i) find upstream molecular signals activated by radiation and identify chemical agents which interfere with the signals thereby increasing the radiation-induced cell deathand (ii) elucidate radiation-induced gene activation, which render the cells sensitive to chemotherapy drugs. The Specific Aim 2 was to investigate the effectiveness of drugs identified in the above mentioned in vitro study against in vivo human tumor xenograftsin nude mice. The Specific Aim 3 was to develop heat-sensitive liposomes for increasing the delivery of drugs developed in Specific Aim 1 to target tumor cells.
Results
We investigated the mechanisms underlying the activation of ATM kinase, an upstream signals in irradiated cells, and its downstream signals leading to G2 arrest after radiation exposure. We found that caffeine, wortmannin, pentoxifylline and methylxathine can significantly suppress the radiation-induced activation of ATM kinase, thereby sensitizing tumor cells to radiation. Among the four drugs, caffeine was most effective to radiosensitize tumor cells in vitro on the same moral base. Flow cytometric study and western blotting analysis indicated that the suppression of ATM kinase activity lead to alteration of kinases responsible fur cell cycle progression resulting in ablation of radiation-induced G2 arrest, thereby depriving cells of opportunity to repair radiation damage during G2 arrest. We observed that ionizing radiation and B-lapachone, a bioreductive drug, synergistically kill tumor cells. The mechanisms of cell death caused by B-lapachone has not yet been firmly established, but it was previously proposed that reduction of B-lapachone mediated by NAD(P)H:Quinone Oxidoreductase (NQO1) is an essential process for the B-lapachone-induced cell death. We observed that ionizing radiation causes long-lasting activation of NQO1, indicating the synergistic interaction of B-lapachone and radiation is due to radiation-induced up regulation of NQO1 leading to sensitization of cancer cells to B-lapachone. This result clearly demonstrated that radiation-induced activation of certain genes may be exploited to sensitize target cancer cells to chemotherapy drugs. We also observed that not only ionizing radiation but certain chemotherapy drugs such as cisplatin ormild temperature hyperthermia activate NQO1, thereby sensitizing cancer cells to B-lapachone and also other bioreductive drug such as mitomycin C.
We observed that an i.p. injection of 0.2 mg/g caffeine to nude mice bearing RKO human colorectal cancer in hind legs markedly increased the effect of subsequent local irradiation of the tumors with 10 Gy to suppress the tumor growth. The caffeine treatment increased the radiation-induced tumor growth delay by a factor of 1.63.
In order to increase the delivery of chemotherapy drugs or radiosensitizing drugs to target tumor cells in vivo, we have developed liposomes which are liable to break at moderately high temperature, i.e. 39-42$^{\circ}C$. We have succeeded formulating heat-liable liposomes using DPPC:DMPC:DSPC (4:1:1: molar ratio) in which caffeine was capsulated.
Liposomes with similar size were selected by repeated extrusion with 0.2 um pore- sized membrane. In vitro studies demonstrated that caffeine could be effectively released from the caffeine/liposome complex upon heating at 42$^{\circ}C$ and sensitized tumor cells to radiation. In order to evaluate the efficacy of the caffeine/liposome complexes to radiosensitize tumors in vivo, we administered the caffeine/liposome through tail vein to tumor-bearing mice, heated the tumors 30 min later with 42$^{\circ}C$ water bath for 30 min and then irradiated the tumors with 10 Gy X-rays. Such a treatment markedly increased the radiation-induced tumor growth delay, which was apparently greater than the tumor growth delay caused by an administration of caffeine solution before tumor irradiation. Experiments are in progress to further increase the deliver of drugs to target tumor cells by labeling the liposome with EGFR-antibody.
Conclusion
We have observed that it is feasible to sensitize cancer cells to radiation by interfering the radiation-induced signals vital for the repair of radiation damage. We also have found for the first time that the radiation-induced activation of certain gene such as NQO1 can be exploited to increase the sensitivity of cancer cells to bioreductive drugs. We have clearly demonstrated that it is feasible to increase the delivery of radiosensitizing drugs or chemotherapy drugs to target cells using heat-liable liposome and locally heating the target tumors at mild temperatures.

목차 Contents

• I. 연구개발결과 요약문...1
  • 요약문...1
    • 
      Project Summery...3
    II. 총괄연구개발과제 연구결과...5
  • 1. 총괄연구개발과제의 최종연구 개발목표....5
    • 
      2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과....6
    • 
      3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론....9
    • 
      4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도....10
    • 
      5. 총괄연구개발과제의 활용계획....16
    • 
      6. 첨부서류....17
    III. 제1세부연구개발과제 연구결과...18
  • 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표....19
    • 
      2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법....21
    • 
      3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과....23
    • 
      4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론....38
    • 
      5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도....39
    • 
      6. 제1세부연구개발과제의 활용계획....44
    • 
      7. 참고문헌....44
    IV. 제2세부연구개발과제 연구결과...45
  • 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표....46
    • 
      2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법....48
    • 
      3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과....50
    • 
      4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론....56
    • 
      5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도....57
    • 
      6. 제2세부연구개발과제의 활용계획....61
    • 
      7. 참고문헌....61
    V. 제3세부연구개발과제 연구결과...62
  • 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표....63
    • 
      2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법....63
    • 
      3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과....66
    • 
      4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론....73
    • 
      5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도....74
    • 
      6. 제3세부연구개발과제의 활용계획....76
    • 
      7. 참고문헌....76