초록 ▼

간세포 성장인자(HGF)는 여러 종류의 앞의 발달과 전이에 중대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 그러나, 간세포 성장인자에 대한 연구의 부족으로 이에 대한 항체는 아직 상업화되지 않은 실정이다. 본 연구자는 간세포 성장인자와 그 수용체를 토끼에게 면역하여, 파지 디스플레이를 이용한 항체 라이브러리를 제작하고, 간세포 성장인자에 대한 토끼/인간 카이메릭 항체를 개발하였다. 이 항체는 SFN 68이라 명명되었고, 이 항체가 간세포 성장인자에 의한 여러 생물학적 기작을 억제함을 여러 실험을 통해 입증하였다. 또한, 간세포 성장인자의

간세포 성장인자(HGF)는 여러 종류의 앞의 발달과 전이에 중대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 그러나, 간세포 성장인자에 대한 연구의 부족으로 이에 대한 항체는 아직 상업화되지 않은 실정이다. 본 연구자는 간세포 성장인자와 그 수용체를 토끼에게 면역하여, 파지 디스플레이를 이용한 항체 라이브러리를 제작하고, 간세포 성장인자에 대한 토끼/인간 카이메릭 항체를 개발하였다. 이 항체는 SFN 68이라 명명되었고, 이 항체가 간세포 성장인자에 의한 여러 생물학적 기작을 억제함을 여러 실험을 통해 입증하였다. 또한, 간세포 성장인자의 항원결정부위를 규명하기 위해 펩타이드 라이브러리를 이용하여 SFN 68의 항원결합부위에 결합하는 펩타이드를 찾아내어 HMP 12라 명명하였다. 추후의 실험에서 이 펩타이드는 간세포 성장인자 수용체와 결합을 하고, 성장인자 그 수용체의 결합을 억제함을 밝혀내었다.
SFN 68에 대한 연속된 연구로서, 본 연구자는 SFN 68의 기능을 유지하면서 비인간 항체에서 야기될 수 있는 면역원성을 줄이기 위해 SFN 68의 인간화 항체 제작을 진행하였다. 먼저, SFN 68의 토끼 유래 가변 경사슬 영역을 인간의 가변 경사슬 영역으로 치환하고, 인간의 가변 중사슬 영역의 골격부위에 토끼 가변 중사슬 영역의 항원결합부위를 이식하여 인간화된 항체 라이브러리를 제작하였다. 이식하는 과정에서 토끼 가변 중사슬 영역의 항원 결합부위의 구조에 영향을 줄 수 있다고 판단된 인간 가변 중사슬 영역의 잔기는 토끼의 것과 인간의 것을 모두 넣어 SFN 68 항체의 결합력을 유지하는 클론을 선별할 수 있도록 라이브러리를 제작하였다. 이 라이브러리를 사용하여 간세포 성장인자에 대한 친화도에 근거한 선별과정에서 4가지의 인간화된 SFN 68 항체를 클로닝 할 수 있었고, 이 항체들 또한 간세포 성장인자에 대한 결합력과 성장인자와 수용체간의 결합을 억제하는 능력을 유지하고 있음을 실험을 통해 알 수 있었다.
마지막으로 동물 모델에서 간세포 성장인자에 대한 중화 능력 검증에 필요한 항체를 얻기 위해 동물세포에서 항체를 발현하는 벡터 시스템을 제작하고, 특정 항체를 과발현하는 세포주의 제작을 수행하였다. 동물세포로는 중국 햄스터 난소 세포주의 하나인 BG44를 선택하였고, 이 세포주에 DHFR (dihydrofolate reductase) 유전자와 whole IgG 형태의 SFN 68 항체를 코딩하는 유전자를 갖는 두 개의 발현 벡터를 이용하여 항체를 발현하는 시스템을 개발하였다. 발현된 항체는 세포외부의 배양액으로 분비되도록 경사슬과 중사슬을 코딩하는 DNA 염기 서열 앞에 leader sequence를 삽입하였다. 제작된 벡터는 중국 햄스터 난소 세포주에 형질전환한 후 항체와 DHFR을 발현하는 형질전환체 클론을 선별하기 위해 methotrexate (MTX)를 사용하여 MTX 저항성 클론을 선별하면서 동시에 항체를 발현하는 클론을 선발할 수 있었고, 발현된 항체는 간세포 성장인자에 대한 친화력을 그대로 유지하고 있음을 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)를 통하여 알 수 있었다.

Abstract ▼

Hepatocyte growth factor (HGF) / scatter factor (SP) exhibits profound effects on the invasive behavior of a wide variety of tumor cells. Despite its potential as an anti-tumor and anti-metastatic agent, an antibody to HGF has not yet been commercialized due to the ack of the information of HGF. Her

Hepatocyte growth factor (HGF) / scatter factor (SP) exhibits profound effects on the invasive behavior of a wide variety of tumor cells. Despite its potential as an anti-tumor and anti-metastatic agent, an antibody to HGF has not yet been commercialized due to the ack of the information of HGF. Here, we immunized HGF in complex with its receptor cMet, generated rabbit/human chimeric antibody using phage display and developed the anti-HGF antibody. The cloned anti-HGF Fab was named to SFN68 and it was shown that SFN 68 inhibited various biological effects by HGF. Also, for the characterization of HGF epitope, we cloned a peptide mimicking the epitope of HGP using a combinatorial peptide library and named the peptide "HMP12". It was found that HMP12 bound to cMet and then inhibited the binding of HGF and cMet.
Our another approach was to humanize SFN 68 to overcome the immunogenicity of non-human antibody without the loss of binding activity. We constructed a combinatorial library which composed of a set of fully human variable light chain and complementary determining region of variable heavy chain grafted human variable heavy chain. Also, the critical framework residues which could influence the conformation of the antigen binding site were randomized to retain the binding affinity of SFN 68. Affinity panning of a library of humanized SFN 68 (HSFN 68) antibody led to the selection of four variants with greater or similar affinity for HGF relative to the Initial antibody. These four HSFN 68 clones were found to inhibit the interaction between HGF and cMet.
Finally, for the preparation of antibodies for the neutralizing test against HGF in animal model, we constructed a vector system producing antibodies in mammalian cells and estabilished a cell line expressing antibodies. DG44, DHFR deficient CHO cell was selected as a host and two vector carrying DHFR (dihydrofolate reductase) gene and the whole antibody formatted SFN68 coding fragment were constructed. Those vectors contained the loader sequence for the secretion of antibody into the culture supernatant. Two expression vectors were co-transfected into DG44 and transformants producing SFN68 antibody were selected in the presence of MTX. The produced SFN68 antibody showed the specific binding affinity to HGF in ELISA.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...3
• 목차...4
• I. 연구개발결과 요약문...5
• 한글요약문...5
• Project Summery...6
• II. 연구개발과제 연구결과...7
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표...7
• 2. 연구개발과제의 연구대상 및 방법...8
• 3. 연구개발과제의 연구개발결과...10
• 4. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...13
• 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...15
• 6. 연구개발과제의 활용계획...17
• 7. 참고문헌...18
• 8. 첨부서류...18