초록 ▼

본 연구의 목표는 악성빈혈치료제로 현재 전세계적으로 각광을 받고 있는 생물의약품인 EPO(에리스로포에틴)를 재조합 동물세포에서 생산하는데 있어서 암모니아를 제거하는 시스템과 당쇄합성 증강 시스템을 도입하여 정확한 당쇄구조를 가진 고품질의 EPO를 대량생산할 수 있는 체제를 구축하는데 있다.
o 당쇄합성에 관련된 당전이효소(시알산전달효소(ST), 갈락토오스전달효소(GT)) 유전자를 EPO 생산 세포주(CHO EC1)에 도입시켜 각각의 당쇄구조를 분석하였다. 그리고 ST 발현 세포주(ST2)에 EPO 생산성 증가의 일환인 N-Ac

본 연구의 목표는 악성빈혈치료제로 현재 전세계적으로 각광을 받고 있는 생물의약품인 EPO(에리스로포에틴)를 재조합 동물세포에서 생산하는데 있어서 암모니아를 제거하는 시스템과 당쇄합성 증강 시스템을 도입하여 정확한 당쇄구조를 가진 고품질의 EPO를 대량생산할 수 있는 체제를 구축하는데 있다.
o 당쇄합성에 관련된 당전이효소(시알산전달효소(ST), 갈락토오스전달효소(GT)) 유전자를 EPO 생산 세포주(CHO EC1)에 도입시켜 각각의 당쇄구조를 분석하였다. 그리고 ST 발현 세포주(ST2)에 EPO 생산성 증가의 일환인 N-Acetylcysteine를 처리하였을때, 당쇄구조를 분석하였다.
o 요소회로 효소 유전자들을 EPO를 생산하는 CHO세포주(IBE)에 도입시켜 형질 전환 세포주(CO5)를 만들고 암모니아 농도 및 세포성장을 측정하였고, 생산된 EPO 의 당쇄구조를 분석하였다. 그리고 세포성장과 EPO 생산 증가를 위해 온도와 배지조성 조건을 조사하였다.
o 동물세포배양시 생산되는 EPO의 단백질 정제법을 확립하였고, 형광물질및 HPLC/MALDI-TOF를을 이용한 당쇄구조분석법을 구축하였다. 또한 EPO 세포에 대한 무혈청 배지 및 배양법을 확립하였다.
o 당전이효소(ST/GT)를 도입한 형질전환 세포주에서 생산된 EPO의 시알산 함량이 증가하였고, 특히 GT/ST를 동시에 발현시켰을때 그효과가 더 컸다. EPO 생산성을 증가시키기 위해 세포배양시 NAC를 처리하였을때 EPO 시알산 함량이 떨어지게 되는데, ST를 발현한 세포주의 경우, NAC를 처리하였을때, 감소한 EPO 시알산 함량이 다시 원상대로 증가되었다.
o 요소회로 유전자들을 CHO 세포에 도입하였을때 세포주의 세포성장이 증가되었고, EPO 생산성도 향상되었다. 특히 생산되는 EPO의 시알산 함량도 증가되었다. 또한 무혈청배지의 첨가물과 저온 적응 배양의 조건에 의해 세포성장 및 EPO 생산성이 증가되었다.
o 세포배양중에 생산되는 EPO의 one-step 정제법을 확립하였고, 2가지 형광물질 (2-AB/2-AP)과 HPLC/MALDI-TOF를 이용하여 당단백질의 당쇄구조분석법을 구축하였다. 또한 CHO 세포배양시 최적조건의 무혈청배지 및 배양법을 확립하였다.
o 본 연구결과로 동물세포배양에서 재조합 당단백질 생산시 암모니아 독성을 감소시키고 당전이효소를 발현시킴으로써 당단백질의 생산성 증가와 더불어 당쇄구조가 향상된(시알산 함량증가) 고품질의 당단백질을 생산할 수 있는 시스템을 구축하였다.

Abstract ▼

In order to develop a EPO production system with high production and high quality in CHO cells, the glycosyltransferases and the enzymes related to Urea cycle which enhance glycosylation module and reduce the ammonium ion in the medium are introduced to EPO producing CHO cells. Also, the system of g

In order to develop a EPO production system with high production and high quality in CHO cells, the glycosyltransferases and the enzymes related to Urea cycle which enhance glycosylation module and reduce the ammonium ion in the medium are introduced to EPO producing CHO cells. Also, the system of glycan structural analysis for a glycoprotein is established.
o Two glycosyltransferases were obtained and expressed in EPO producing CHO cell(EC1) and the glycan structures of the obtained EPO were analyzed. And the transformed cells were cultured with N-acetylcysteine (NAC), the glycan structural analysis of EPO was done.
o The Urea cycle genes were expressed into IBE (EPO expressing CHO cells) by stable transfection. The resulting cell line, CO5 was cultured, and a cell growth, ammonia concentration, and the glycan structures of produced EPO were analyzed. And temperature condition and medium composition were changed with the aim of increasing growth and EPO production in IBE and CO5 cells.
o A EPO purification method was developed, and the system of glycan structural analysis for a glycoprotein is established with fluorescence chemical and HPLC/MALDI-TOF.
o Expression of glycosyltransferases (ST/GT) in CHO cells enhanced the sialylation of recombinant EPO, and NAC supplement and ST expression in CHO cells increased not only EPO production level but EPO sialylation.
o Expression of the enzyme related to the Urea cycle in CHO cells increased the cell growth, EPO production level, and the sialic acid level of EPO. And the cell growth and EPO productivity were enhanced by low temperature condition with serum-free media and additives.
o One-step purification methods for EPO was developed. And the system of glycan structural analysis for a glycoprotein was established with two fluorescence chemicals and HPLC/MALDI-TOF. And serum-free condition for CHO cell culture was optimized.
o These results can be applied to improve the quality as well as productivity
of other recombinant glycoproteins in mammalian cell culture.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문...4
• 2. 영문요약문...5
• Ⅲ. 연구내용...6
• 1. 서론...6
• 2. 연구방법 및 이론...12
• 3. 결과 및 고찰...22
• 4. 결론...54
• 5. 인용문헌...55