본 연구는 잔류성과 독성면에서 문제가 되고 있는 유기염소계 농약 인 endosulfan 및 PCNB와 그들의 분해대사산물들을 대상으로 환경 중에서의 동태를 정확히 규명하여 오염된 토양을 산화환원적 처리제와 미생물로 복원시키는 것을 최종목적으로 하고 있다.
1. 유기염소계 농약의 무독화를 위한 산화환원촉매의 이용 Endosulfan의 오염 현황 조사 및 토양 중 동태규명 한 후 이들로 오염된 토양의 무독화를 위한 연구(Oxidative catalyst, Abiotic catalyst Fenton reagent, 석회
본 연구는 잔류성과 독성면에서 문제가 되고 있는 유기염소계 농약 인 endosulfan 및 PCNB와 그들의 분해대사산물들을 대상으로 환경 중에서의 동태를 정확히 규명하여 오염된 토양을 산화환원적 처리제와 미생물로 복원시키는 것을 최종목적으로 하고 있다.
1. 유기염소계 농약의 무독화를 위한 산화환원촉매의 이용 Endosulfan의 오염 현황 조사 및 토양 중 동태규명 한 후 이들로 오염된 토양의 무독화를 위한 연구(Oxidative catalyst, Abiotic catalyst Fenton reagent, 석회, Zero-valent iron의 처리, Algae에서의 분해양상)를 행하였다. 2. 유기염소계 농약의 분해를 위한 미생물학적 연구 분해 관련 미생물의 분리 및 콘소시움 균주 동정하고 그 미생물의 특성 규명 및 배양방법 확립 후 단독 혹은 콘소시움 형태의 환경적응시험을 행하였다. 3. 선발된 분해균주의 분자생물학적 연구 오염원에서의 우수분해 미생물 선발 및 분해특성 검정하고 분해경로의 분자생물학적 규명 분해유전자 cloning을 통한 그 분해과정 및 분해 미생물의 분자생물적 추적방법 확립하며 In situ 오염처리에 있어서 분자생물학적 추적 system 적용시험 및 처리과정의 최적화 조건 탐색하고자 하였다.
1. 유기염소계 농약의 무독화를 위한 산화환원촉매의 이용 경작지의 토양과 농산물을 채취하여 분석한 결과 대부분의 토양에서 endosulfan이 검출 되었으며 최고 $\alpha$ 5.31mg/kg, $\beta$ 3.97mg/kg으로 나타났다. 대사물질인 endosulfan sulfate도 1.26mg/kg으로 나타났다. 농작물에서 대다수가 잔류허용치 이하였지만 채소류에서는 상당한 빈도로 검출되었다. 기질 단독에 대한 산화환원촉매들의 반응성은 상당히 작았으며 특히 endosulfan sulfate의 경우는 반응성이 거의 없는 것으로 나타났다. 첨가한 humic monomer에 의해 endosulfan의 transformation율이 조금 증가되는 것이 확인되었으나 그 정도가 아주 미미한 것으로 나타났다. $\alpha$ 및 $\beta$-endosulfan은 Fenton reagent, zero-valent iron(ZVI), 석회 처리등 화학적 처리에 의해 분해가 일어났으나 주 대사물질인 endosulfan sulfate는 ZVI를 제외하고 매우 안정한 것으로 나타났다. 알칼리 처리에서는 endosulfan diol로 주로 분해가 되었으며 ZVI를 통한 처리에서 탈염소화된 물질이 생성되는 것을 확인하였다. Anabaena flos-aquae의 endosulfan 분해 실험에서는 생물학적 가수분해에 의하여 endosulfan diol이 생성되는 메카니즘을 밝혔으며 이는 endosulfan을 무독성화 시키는 중요한 메카니즘에 Anabaena 종이 관여하고 있음을 보여 주었다. 2. 유기염소계 농약의 분해를 위한 미생물학적 연구 Endosulfan 화합물을 대상으로 이들을 탄소원으로 사용할 경우 생육이 일어나는 특성을 갖는 분리균주 KE-1과 KE-8 두 균주를 분리 동정하여 분리, 보존되었다. 새로운 endosulfan 분해균주인 K. pneumoniae KE-1은 각각 pH 8.0, 배양온도 30$^{circ}C$에서 endosulfan에 대해 매우 높은 분해활성을 나타내었으며, 또한 endosulfan을 분해하면서 문제시되는 독성화합물인 endosulfan sulfate를 생성하지 않았으며 endosulfan의 가수분해경로를 이용한 endosulfan ether, endosulfan diol등으로의 대사산물을 생성하였고 배지 내에서 sulfate 농도가 초기 240 ${\micro}g$/ml에서 286 ${\micro}g$/ml로 증가하는 결과를 보였다. 따라서 K. pneumoniae KE-1은 1차적으로 endosulfan의 sulfate group을 cleavage 시키면서 endosulfan diol로 분해하고 이어 endosulfan ether로의 non-toxic metabolic pathway를 이용한 분해작용을 하는 것으로 추정된다. K. oxytoca KE-8균주의 특성은 endosulfan의 대사과정에서 생산되는 endosulfan sulfate를 첨가할 경우에도 우수한 생육특성과 함께 다른 난분해성화합물(phenol성 화합물, PCNB 등)에 대한 분해활성도 또한 높은 것으로 조사되었다. 따라서 KE-8균주가 갖는 특성과 앞서 살펴 본 KE-1균주의 특성을 이용한 single culture 또는 mixed culture의 방법을 통한 효율적으로 활용이 될 경우 endosulfan을 비롯한 유사화합물에 대한 빠른 생육과 분해활성을 유도할 수 있는 제제로의 개발 가능성을 나타내었다. 3. 선발된 분해균주의 분자생물학적 연구 PCNB분해균으로서 Alcaligenes denitrificans PCNB-2를 토양에서 분리$\middot$동정하였다. 이 균은 PCNB(100ppm)을 유일한 탄소원으로 성장할 수 있었다. 최종 선발된 endosulfan 분해균주인 Klebsiella oxytoca KE-8과 PCNB분해균주인 Alcaligenes denitrificans PCNB-2를 이용하여 성장실험을 실시한 결과, 천연기질인 plant extract A 및 퇴비추출물을 사용한 경우 성장의 상승효과가 나타났다. Endosulfan의 분해가 이루어지는 토양 microcosm실험에 있어서 추출된 총 토양 DNA로부터 PCR-DGGE과정을 거친 후 DGGE 패턴상의 밴드로부터 직접 DNA를 회수한 후 염기서열을 확인함으로써 미생물군집구조 결정을 미생물을 분리할 필요가 없이 효과적으로 수행할 수 있었다. Klebsiella oxytoca KE-8 군주를 접종하여 토양에서 endosulfan 분해실험을 수행한 결과 이 균주에 의한 Endosulfan의 직접 분해효과를 인정하기 어려웠다. 토착균에 의한 endosulfan 분해 촉진 효과가능성을 검정할 수 있었다.
Abstract▼
The objectives of this proposal are restore to original state soil contaminated with endosulfan and PCNB through bioremediation that indicate the use of techiques suitable for partial or total recovery of a contaminated system.
1. Detoxification of endosulfan by oxidative catalysts We cond
The objectives of this proposal are restore to original state soil contaminated with endosulfan and PCNB through bioremediation that indicate the use of techiques suitable for partial or total recovery of a contaminated system.
1. Detoxification of endosulfan by oxidative catalysts We conducted the investigation of not only degradation pattern, adsorption, leaching and bound residue of endosulfan to identify the behaviors in soil, but also detoxification through oxidative coupling and various chemical treatment. Reactivity of endosulfan by oxidoreductive catalysts, Ca(OH)2, zero valent iron and Fenton reagent will be estimated to evaluate the possibility of detoxification. We also assessed the role of the blue-green algal species present on the soil in the dissipation of endosulfan and its metabolites. 2. Screening of PCNB and endosulfan biodegraders Biodegradative activities of PCNB and endosulfan will be tested for the strains that can degrade the analogues of PCNB and endosulfan. Isolation and selection of PCNB and endosulfan degraders will be performed from native contaminated samples, and their taxonomic status will be identified. Metabolic pathways of PCNB and endosulfan will be investigated for the strains of higher degradative activity. The metabolic intermediates can be used for the oxidative coupling experiments described above. 3. Molecular biological study of degradative microbial strain The goal of this study is to develop an infrastructural technology applicable to in situ bioremediation of PCNB and their metabolites. The research is summarized as follows: (a) Strain isolation and selection from various environmental sources and characterization o their biodegradation capability. (b) Molecular analysis of PCNB degradation pathway, cloning of the degradative genes, and development of the molecular monitoring techniques. (c) Application test of molecular monitoring techniques to in situ bioremediation of PCNB and optimization of the remediation process. This study is expected to significantly contribute to in situ bioremediation of PCNB, and to play an important role in removing the persistency and ecological risks of PCNB from soil, aquatic environments and other sources such as agricultural products.
1. Detoxification of endosulfan by oxidative catalysts It was found that endosulfan was detected in Kyungpook region agricultural vegetable and fruit soils. Maxium concentration was $\alpha$-endosulfan 5.31, $\beta$-endsoufan 3.97 and endosulfan sufate 1.26 mg/kg. Most of products were detected below detection limit but vegetable was detected frequently. Reactivity of oxidoreductive catalyst for endosulfan was very low and endosulfan sulfate was inert to catalyst. Addtions of humic monomer increase the transforamtion rates of endosulfan but this degree was very small. $\alpha$ and $\beta$-Endosulfan was disappeared by Fenton reagent, zero valent iron(ZVI), alkaline treatment. However, major metabolite, endosulfan sulfate was inert except ZVI. Alkaline treatment generated endosulfan diol and ZVI treatment generated dechlorinated compounds. Anabaena flos-aquae transformed endosulfan to endsoufan diol though the biological hydrolysis mechanism this results show that Anabaena species participate in the detoxification process of endosulfan in the soil environment. 2.Screening of PCNB and endosulfan biodegraders We identified KE-1 and KE-8 strains that could use the endosulfan for the enery source. This new endosulfan degradable strain K. pneumoniae KE-1 had very high degradative activiy at pH 8.0 30 $^{circ}C$. and this didn't make the formation of endosulfan sulfate that was seriously problem. these degradation pathway was hydrolysis pathway that generated endosulfan ether and diol. Consequently this strain uses the sulfate resulted from endosulfan hydrolysis. It was found that K. oxytoca KE-8 strain had a endosulfan degradable property in the presence of endsoufan sulfate and other compounds(phenol, PCNB etc) degradable ability. 3. Molecular biological study of degradative microbial strain We identified Alcaligenes denitrificans PCNB-2 that could degrade PCNB from soil. This strain used the PCNB for the energy source. In growth experiment of endosulfan degrader, Klebsiella oxytoca KE-8 and PCNB degrader, Alcaligenes denitrificans PCNB-2, we found that positive growth effect in using the plant extract A and extracts of compost. PCR-DGGE method made easily our identify the microorganism group without screening of microorganism. We inoculated Klebsiella oxytoca KE-8 in soil to investigate degradation of endosulfan by this strain, however, we could not found that endosulfan degradation was caused by this strain. So we are studying in detail
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