초록 ▼

연구목표
특정 암세포에 과잉으로 발현되거나 암세포 증식에 관련된 단백질과 DNA를 둘 다 수식하는 화합물의 선택적인 세포독성에 관련된 생화학적 기전을 규명하고, 이 기전에 따라 작용할 독특한 항암제 유도체의 구조를 분자 설계하는 것이다.
연구내용
[1차년] (1) E2-Mustard가 선택적으로 세포사멸을 유도하는 기전으로서 약물의 DNA 결합체에 ER이 결합함으로써 DNA lesion이 감추어져서 DNA 복구효소에 의해 제거되지 않고 잔존하여 세포사멸을 유도하는가를 E2-Mustard의 plamid DNA 결합체에

연구목표
특정 암세포에 과잉으로 발현되거나 암세포 증식에 관련된 단백질과 DNA를 둘 다 수식하는 화합물의 선택적인 세포독성에 관련된 생화학적 기전을 규명하고, 이 기전에 따라 작용할 독특한 항암제 유도체의 구조를 분자 설계하는 것이다.
연구내용
[1차년] (1) E2-Mustard가 선택적으로 세포사멸을 유도하는 기전으로서 약물의 DNA 결합체에 ER이 결합함으로써 DNA lesion이 감추어져서 DNA 복구효소에 의해 제거되지 않고 잔존하여 세포사멸을 유도하는가를 E2-Mustard의 plamid DNA 결합체에 대하여 ER 존재 유무에 따른 in vitro DNA repair synthesis assay를 수행하여 복구정도를 비교하였다. (2) E2-Mustard의 구조를 ER의 binding site에 flexible 도킹을 수행하여 가능한 3차원적 결합형태 모델을 설계하였다. 이는 E2-Mustard의 ER에 대한 결합이 에너지면에서 가능함을 계산하여 결합체형성을 보여준 생화학적 실험결과를 재확인할 수 있었다.
[2차년] (1) 레티노익산 수용체와 리간드의 결합체의 x-ray 결정 구조에 대한 모델링 작업을 통하여 all-trans-retinoic acid (ATRA)와 DNA를 알킬화하는 nitrogen mustard를 연결시킨 리간드인 ‘RA-Mustard’ 구조를 설계하였다. (2) RA-Mustard를 Curtius Rearrangement 반응과 amide coupling 방법으로 합성하였다. (3) RA-Mustard의 레티노익산 수용체와의 결합가능성을 수용체가 과잉발현된 cell extract에 대하여 방사능 표지된 [3H]-ATRA와의 리간드 경쟁결합 시험을 통하여 확인하였다. (4) 생화학적 작용기전연구로서 RA-Mustard의 DNA 결합체 형성여부를 Gel Migeration Shift Assay와 DNA Strand Breakage Assay로서 확인한 후 리포터 유전자분석에 사용할 plasmid DNA에 결합체를 형성시켰다.
연구성과
In vitro nucleotide excision repair 실험결과는 ER-LBD를 가함에 따라 복구효율이 50-60 % 감소함을 보여 주었다. 이 결과는 ER-LBD가 E2-Mustard : DNA 결합체에 DNA repair complex가 접근하는 것을 차단함을 보여주어 (repair-shielding model), cell culture를 이용한 실험에서 E2-Mustard가 ER이 과잉으로 존재하는 ER-positive 유방암 세포를 선택적인 세포독성이 나타났던 현상에 관련된 기전임을 증명할 수 있었다. 본 연구에서 최적화된 DNA repair assay system은 E2-Mustard처럼 “암세포특유의 단백질 결합 도메인 + linker + DNA 알킬화제”로 조합된 구조의 화합물들의 생화학적 기전연구에 효과적으로 응용할 수 있는 방법이고, 증명된 repair-shielding model은 새로운 단백질을 targeting하는 유사개념의 항암 유도체 설계방법이론을 확립에 기여했다.
분자모델링을 이용하여 설계한 새로운 bifunctional agent인 RA-Mustard는 ATRA에 합성적인 도입이 가능한 linker와 nitrogen mustard unit을 붙인 구조를 설계한 후 flexible docking 방법으로 분석하여 레티노익산 수용체결합 가능성을 확인하고 합성한 화합물이다. 리간드 경쟁결합 시험과 DNA Strand Breakage Assay로서 이 화합물이 ATRA와 경쟁하여 수용체에 결합할 수 있고 nitrogen mustard unit은 bulky한 유도체의 형태로도 DNA와 결합체를 형성할 수 있음을 확인했다. E2-Mustard와 RA-Mustard는 특정 생화학적 작용기전과 표적 수용체의 구조를 기반으로 합리적으로 설계된 화합물로서 표적할 질환관련 단백질이 과잉생성되는 세포에 대한 선택성을 부여한 프로그램화된 선도물질이다. 본 연구과제를 통해 약물구조의 컴퓨터를 이용한 분자설계, 합성, 생화학적 기전연구등을 포함한 총괄적인 연구경험은 생리활성이 뛰어난 유사개념의 새로운 유도체 약물설계에 기반이 될것이다.

Abstract ▼

Purpose of Research
The goal of this project is to investigate the mechanism of selective cytotoxicity of the DNA damaging agent tethered to ligand for the tumor-specific or -related protein, and rationally design analogous compounds based on this mechanism.
Contents of Research
[1st Year]

Purpose of Research
The goal of this project is to investigate the mechanism of selective cytotoxicity of the DNA damaging agent tethered to ligand for the tumor-specific or -related protein, and rationally design analogous compounds based on this mechanism.
Contents of Research
[1st Year] E2-Mustard consists of a DNA-alkylating nitrogen mustard tethered to 17-estradiol, a ligand for the estrogen receptor (ER). A gel migration shift assay revealed that DNA adducts of the E2-Mustard can bind tightly to the ligand-binding domain fo ER (ER-LBD). This result suggests the possibility that the DNA adducts can be camouflaged by their association with the ER; making them difficult for DNA repair proteins to detect. We have used an in vitro DNA repair synthesis assay to determine the effect of the ER-LBD on the repair process. The assay was conducted by using a DNA plasmid modified by E2-Mustard. Repair was studied in the absence or in the presence of the ER-LBD. The addition of the ER-LBD resulted in 50-60% drop in the level of repair of drug-modified DNA.
[2nd Year] We have designed a bifunctional agent (RA-Mustard) which is composed of two parts: a DNA-alkylating nitrogen mustard connected to a retinoid (all-trans-retinoic acid) for the retinoic acid receptor (RAR) by means of a linker that allows the RAR to bind to the DNA adducts formed by the nitrogen mustard. RA-Mustard was synthesized by using Curtius Rearrangement as key reaction. The binding of the RA-Mustard to RAR was examined by a competitive binding assay with [3H]-ATRA against the extract of RAR-overexpressed monky kideny COS cell. The modification of DNA by the RA-Mustard was monitored by DNA strand breakage assay after treating the RA-Mustad to DNA oligomer duplex.
Effectiveness of Research
The E2-Mustad was designed to produce DNA adducts that are difficult for ER expressing cancer cells (i.e., ER-positive breast cancer cell) to repair. The results suggest that the ER-LBD blocks the access of the DNA repair complex to the DNA adduct of E2-Mustard. Thus, the adduct would become more persistent in cancer cells that express the ER, which would contribute to the selective toxicity of the drug to the ER-abundant cells.
A retinoic acid receptor (RAR) usually forms a heterodimer with RXR (Retinoid X Receptor) and binds to a promoter, RA response element (RAREs) to initiate related gene expression or affect the cell signaling pathway. Retinoids (RAR agonists) induce cell differentiation and death, and can be used for cancer therapy. In some cases, retinoids can also act as a strong teratogen. It is very important to study the complicated biological roles of retinoids to develop a selective RAR modulator. In this study we have designed a new programmed genotoxin RAR-Mustard which may act as novel therapeutic agent but also be used as experimental probe molecules for the study of biochemical mechanism of action of retinoids.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문 ...3
• 1. 국문요약문 ...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문 ...4
• 1. 국문요약문 ...4
• 2. 영문요약문 ...5
• Ⅲ. 연구내용 ...6
• 1. 서론 ...6
• 2. 연구방법 및 이론 ...8
• 3. 결과 및 고찰 ...12
• 4. 결론 ...15
• 5. 인용문헌 ...16