초록 ▼

최근의 유전학적 연구에 의하면 남성불임환자들의 많은 수가 Y 염색체 상의 특정 부위에 빈번하게 결실을 포함하고 있음을 확인하였고, 이에 따라 이 부위에 위치한 유전자들이 정자 형성과정에 중요한 역할을 담당할 것으로 추측되었다. 하지만 이들 불임유전자들의 결핍이 어떻게 남성불임을 유도하는지에 관하여 아직 이해되지 않고 있는 실정이다. 그러므로 본 연구의 최종 목표는 "불임유전자의 생물학적 기능을 분자 수준에서 이해"하는 것이다. 본 연구에서는 유전자 결실이 가장 빈번하게 일어난다고 알려진 불임유전자들인 Rbm 및 Dffry의 발현 및

최근의 유전학적 연구에 의하면 남성불임환자들의 많은 수가 Y 염색체 상의 특정 부위에 빈번하게 결실을 포함하고 있음을 확인하였고, 이에 따라 이 부위에 위치한 유전자들이 정자 형성과정에 중요한 역할을 담당할 것으로 추측되었다. 하지만 이들 불임유전자들의 결핍이 어떻게 남성불임을 유도하는지에 관하여 아직 이해되지 않고 있는 실정이다. 그러므로 본 연구의 최종 목표는 "불임유전자의 생물학적 기능을 분자 수준에서 이해"하는 것이다. 본 연구에서는 유전자 결실이 가장 빈번하게 일어난다고 알려진 불임유전자들인 Rbm 및 Dffry의 발현 및 생화학적 특성을 분석함으로써 남성 불임의 원인을 분자생물학 수준에서 규명하고자 한다.

(1) Rbm 결합 유전자 동정: Rbm과 상호 작용하는 단백질을 동정해 내기 위해 yeast two hybrid를 사용하였다.
(2) Rbm 발현 분석: 남성생식세포 발생 과정에 있어서 Rbm의 발현시기를 확인하는 것은 그 기능을 추측하는데 매우 중요하다. Rbm의 발현은 in situ hybridization, immunohistochemistry, 등의 방법으로 조사한다. 이를 위해 i) Rbm 특이 항체 제작, ii) Rbm 유사유전자 동정, 등을 수행하였다.
(3) 결합 RNA sequence를 통한 Rbm target 유전자 동정: Rbm 단백질이 특정하게 인식하는 RNA 염기서열을 알아내는 방법으로 SELEX를 수행하였다. SELEX를 통해 Rbm이 인식하는 특정한 RNA부위들이 확인되면, 이들을 비교해 consensus sequence를 찾아내고 computer database search를 통해 또 다른 Rbm target 유전자를 동정할 계획으로 본 실험을 수행하였다.
(4) DFFRY 분석: 불임유전자의 하나인DFFRY의 생물학적 기능을 분자수준에서 이해하기 위해 본 연구에서는 DFFRY 가 Ubiquitin-specific protease (Ubp)들의 공통적인 활성부위로 주목되는 Cys domain과 His domain을 가지는 것을 근거로, 'DFFRY는 Ubiquitin specific protease를 암호화하는 유전자일 것이다.' 라는 가정하에, DFFRY의 Ubp activity를 bacteria system과 mammalian cell system에서 조사하였다.

(1) Rbm 발현: RNA 및 단백질 수준에서의 발현을 조사한 결과, Rbm은 정원세포 및 초기 정모세포에서만 발현되고, 감수분열 이후의 남성생식세포가 발현됨을 확인 하였다. 이로써 Rbm은 남성생식세포 발생의 초기에 참여함을 확인하였다. 이 결과는 Molecular Human Reproduction에 곧 개재될 예정이다.
(2) Rbm 결합 단백질 유전자 동정: Yeast two hybrid assay 결과, Rbm과 상호 결합하는 단백질로 hnRNP K 와 Tra2$\alpha$ 가 확인되었다. 이러한 결과들은 기존에 본 실험실이 가지고 있던 가정, 즉 'Rbm이 정자 형성 과정중의 RNA metabolism에 관련이 있을 것이다'라는 가설을 지지해 준다. 이 결과는 곧 논문으로 발표할 예정이다.
(3) DFFRY의 Ubiquitin specific protease (Ubp) activity 확인: DFFRY가 Ubp activity를 가지고 있는지를 알아보기 위하여 본 연구에서는 Bacteria-based assay 및 mammalian cell transfection assay 등을 수행하였고, 두 system 모두에서 UBP activity를 확인하였다. 이상의 결과들로 미루어 보아 DFFRY의 기능은 특정 단백질을 분해하는 것이라고 추측할 수 있었다.

Abstract ▼

Recently a number of genetic studies indicated that male infertility patients containdeletions at specific locus of the Y chromosome frequently, leading to propose that these genes encode proteins that are involved in spermatogenesis.However, it remains to be studied how deletions of these genes lea

Recently a number of genetic studies indicated that male infertility patients containdeletions at specific locus of the Y chromosome frequently, leading to propose that these genes encode proteins that are involved in spermatogenesis.However, it remains to be studied how deletions of these genes lead to male infertility. The long-term goal of our project is to elucidate biological functions of infertilitygene at molecular levels. In this proposal, we focused on Rbm and Dffry, which are Y chromosomes genes with high frequenciesin deletion. In this study, we analyzed expression and biochemical characteristics of the male infertility genes.

(1) Isolation of Rbm-Interacting Protein genes: Yeast two-hybrid interaction assays were carried out to isolate the Rbm-Interacting Protein genes.
(2) Expression of Rbm: Specific expression pattern of Rbm provides valuable information on predicting biological functions of Rbm. Rbm expression was studied with in situ hybridization and immunohistochemical analyses. Antibody specific to Rbm was raised. Rbm-related genes were cloned.
(3) Cloning Rbm-target genes: SELEX was carried out to identify specific sequences recognized by Rbm. Once concensus sequence is obtained, we will search database to find genes with the Rbm binding sites.
(4) Biochemical characterization of DFFRY: DFFRY, an infertility gene in AZFa, contains Cys and His domain, characteristic to ubiquitin-specific protease.
Therefore, we detected UBP activity of DFFRY with a bacterial assay system as well as mammalian cell system.

(1) Rbm expression: In situhybridization, immunoblot and immunohistochemistry analyses consistently indicated that Rbm was expressed in spermatogonia and early spermatocytes, but not in pachytene spermatocytes or subsequent stages of differentiation, including haploid germ cells. These observations suggest that Rbm functions in early but not later stages of male germ cell development. These results are about to be published in Molecular Human Reproduction soon.
(2) Isolation of Rbm-Interacting Protein genes: Results from yeast two-hybrid assay revealed specific interactions of Rbm with hnRNP K and Tra2. These interactions support the hypothesis that Rbm is involved in RNA metabolism during male germ cell development. These results are to be published in a near future.
(3) Ubiquitin-specific protease activity in DFFRY: In order to confirm UBP activity of DFFRY, we carried out UBP assay in bacterial system and in mammalian cell system. The results showed UBP activity of DFFRY in both assay system. These results propose that DFFRY might degrade specific proteins during germ cell development.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문 ...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문 ...4
• 2. 영문요약문 ...5
• Ⅲ. 연구내용...6
• 1. 서론 ...6
• 2. 연구방법 및 이론 ...9
• 3. 결과 및 고찰 ...15
• 4. 결론 ...28
• 5. 인용문헌 ...29