보고서 정보
주관연구기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
연구책임자 |
조경현
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2005-10 |
과제시작연도 |
2003 |
주관부처 |
과학기술부 |
과제관리전문기관 |
한국과학재단 Korea Science and Engineering Foundtion |
등록번호 |
TRKO200900070049 |
과제고유번호 |
1350009418 |
사업명 |
기초연구지원 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
아포지단백질.고밀도지단백질.동맥경화.단백질치료제.콜레스테롤.apolipoproteins.high-density lipoprotein.atherosclerosis.protein drug.cholesterol.
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초록
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아포지단백질 A-I (apoA-I)의 point mutant 5 종 (A154E, H155E, V156K, D157K, A158E), A-II point mutant 3종(C6A, P32A, P51A) site-directed mutagenesis 방법으로 생산하였고, 대장균 발현체계를 통해 대량생산하였다. In vitro 에서의 단백질 구조-기능 평가 결과 V156K-apoA-I와 A158E-apoA-I이 구조와 기능에서 독특한 경향을 보여주었는데, V156K는 안정된 2차구조의 유지와 강한 항산화 활성, 우수한 콜레스테롤 배출
아포지단백질 A-I (apoA-I)의 point mutant 5 종 (A154E, H155E, V156K, D157K, A158E), A-II point mutant 3종(C6A, P32A, P51A) site-directed mutagenesis 방법으로 생산하였고, 대장균 발현체계를 통해 대량생산하였다. In vitro 에서의 단백질 구조-기능 평가 결과 V156K-apoA-I와 A158E-apoA-I이 구조와 기능에서 독특한 경향을 보여주었는데, V156K는 안정된 2차구조의 유지와 강한 항산화 활성, 우수한 콜레스테롤 배출 활성을 보여주었다. 고지혈증 생쥐를 이용한 동물실험을 통해 V156K와 A158E를 성능 비교하였으며, 대조군으로 Wildtype apoA-I을 사용하여 비교하였다. 동물실험에서 각 mutant 단백질들의 rHDL들을 제조하여, endotoxin 을 제거하고, 30 mg/kg of body weight 가 되도록 24시간 간격으로 2회 정맥 주사하였다. 주사 후 48시간 경과 후 채혈, 희생하여 분석한 결과 이 Wildtype 과 A158E를 투여한 그룹은 콜레스테롤과 중성지방의 농도가 상승하고 낮은 HDL, 높은 간 기능수치, 높은 IL-6 수치, 바람직하지 못한 아포지단백질 프로필의 부정적 결과를 보여 주었으나, V156K 투여군은 HDL 농도가 증가하고, 낮은 간기능 수치와 낮은 IL-6 등의 우수한 면역염증 억제효과와 콜레스테롤 개선 효과를 보여주었다. Western blot 과 ELISA를 통한 투여 단백질의 혈중 안정성 검사에서 도 V156K가 우수하였고, apo-E의 혈중농도가 상승하는등의 긍정적인 효과가 투여 48시간 이후까지 지속 되었다. 종합적으로 5종의 apoA-I mutant들 중 V156K가 lipid-free 상태와 lipid-bound 상태에서 우수한 in vitro anti-atherosclerotic activity를 보여 주었고, 동맥병변 제거 능력이 있음을 생쥐 모델 실험에서도 입증되었다. 이는 V156K-rHDL이 단백질 치료제로서의 약리적 효과를 보여주는 결과이다.
Abstract
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To examine more precise role of individual amino acids in the vicinity of Val156, serial point mutants of proapoA-I including V156K, D157K, and A158E were overexpressed and purified. In the lipid-free state, A158E showed the strongest self-association patterns and the weakest dimyristoyl phosphatidy
To examine more precise role of individual amino acids in the vicinity of Val156, serial point mutants of proapoA-I including V156K, D157K, and A158E were overexpressed and purified. In the lipid-free state, A158E showed the strongest self-association patterns and the weakest dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC)-clearance activities (T1/2=15±2 min), while V156K showed faster DMPC clearance activity (T1/2= 6±1 min). In the lipid-bound state, A158E made constructed a bigger larger reconstituted HDL, while other mutants and wildtype formed 97 ? of POPC-rHDL. Crosslinking analysis revealed that A158E-rHDL contained at least four molecules of protein in particle, while other rHDL had only two molecules. The V156K and A158E had a decreased activity for LCAT activation in POPC-rHDL state with less than 20% of wildtype reactivity (apparent Vmax/Km). A158E also showed markedly different properties in circular dichroism and chymotrypsin digestion anaylsis, indicating that its three-dimensional structure and accessibility of proteolytic enzyme is different. These results provide a evidences that the two amino acids in helix 6, Val156 and Ala158, is are critical to in regarding to correlations of function and structure of rHDL. Tail vein injection of POPC-rHDL containing each apoA-I variants into hypercholesterolemic mice (C57BL6/J) was carried out with 30 mg of apoA-I/kg of body weight. After injection, wildtype (WT)-rHDL or A158E-rHDL injection caused an abrupt increase of total cholesterol concentration with 47% and 38% compared to before injection, while V156K-rHDL did not provoke the same effect without increase of IL-6 level. Immunodetection revealed that A158E-rHDL had the least protein stability in serum among injected group. V156K-rHDL injected group did not show detectable atherosclerotic lesion and concomitant increase of apo-E protein in serum without increase of serum IL-6.
목차 Contents
- I. 연구계획 요약문...3
- 1. 국문요약문...3
- II. 연구결과 요약문...4
- 1. 국문요약문...4
- 2. 영문요약문...5
- III. 연구내용...6
- 1. 서론...6
- 2. 연구방법 및 이론...11
- 3. 결과 및 고찰...17
- 4. 결론...64
- 5. 인용문헌...65
- 6. 연구결과 논문 별쇄본...69
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