초록 ▼

본 연구과제에서는 PKB의 상부조절인자로 잘 알려져 있는 3-phospho inositide-dependent protein kinase-1 (PDK1)를 another master kinase의 후보물질로써 사전예비연구 결과에 비추어 가정하고 PDK1의 세포내 총체적 신호전달기전을 밝히고져 하는 것이 본 과제의 핵심적인 연구목표이다.

- PDK1 kinase와 STRAP, a TGF-$\beta$ receptor associated protein,의 세포내 상호작용 연구
- PDK1 kinas

본 연구과제에서는 PKB의 상부조절인자로 잘 알려져 있는 3-phospho inositide-dependent protein kinase-1 (PDK1)를 another master kinase의 후보물질로써 사전예비연구 결과에 비추어 가정하고 PDK1의 세포내 총체적 신호전달기전을 밝히고져 하는 것이 본 과제의 핵심적인 연구목표이다.

- PDK1 kinase와 STRAP, a TGF-$\beta$ receptor associated protein,의 세포내 상호작용 연구
- PDK1 kinase와 Ser/Thr kinase인 MPK38와의 세포내 상호작용 연구
- PDK1 kinase와 Thy phosphatase인 PTP-BAS와의 세포내 상호작용 연구
- PDK1 interacting protein인 STRAP(=M21)와 항암억제 유전자인 NM23-H1과의 세포내 상호작용 연구
- PDK1의 세포내 단백질 연결망 구축연구
- TEL, AML1, TEL-AML1 단백질이 CR1 promoter에 미치는 영향 조사 및 분석
- CR1 promoter 전사에서 T/A에 의한 AML1 활성의 억제분석
- target 유전자 (CR1, AML1)의 promoter 조사 및 발현분석
- 세포사멸 유도에 따른 NFkB 활성화에서의 PI3K/PKB의 역할
- 세포사멸 과정에서의 PDK1에 의한 $\beta$-catenin의 전사기능 억제
- Etoposide에 의한 NF-kB activation에서의 PI3-Kinase와 PDK1, Akt의 관련성
- PI3-kinase/PDK1/Akt pathway를 통한 NF-kB 활성화 방법

- 총 9종의 PDK1-inter acting protein을 동정하고 STRAP, MPK38, PTP-BAS등 3종류에 있어서는 논문을 위한 90$\percnt$ 이상 데이터 를 확보하고 있는 실정임.
- STRAP 및 MPK38의 in vivo binding에 필요 한 motif를 조사하고 STRAP은 kinase domain에 그리고 MPK38의 경우는 kinase 및 PH domain 모두 필요함을 관찰할 수 있었다.
- 총 9종의 PDK1-interacting protein에 대한 발현벡터를 모두 제조하고 발현여부를 transfection 및 immunoblot등을 통해 검정 하였음.
- CDK4 kinase assay, MPK38 kinase assay, STRAP activity assay, PDK1 kinase assay, protein tyrosine phosphatase assay등 결합단백질 분석에 필요한 거의 모든 분석법을 구축하였으며, cell death assay 또한 구축하였고 현재 사용중임.
- PDK1과 STRAP, 그리고 MPK38에 대한 생화학적, 생리적 특성에 대한 연구를 현재 거의 완료하고 논문투고 예정이며, 아울러 PDK1 interacting protein인 STRAP에 대한 단백질 상호작용 연구 또한 거의 완료된 실정이다.
이러한 현재까지의 축적된 실험결과에 의해 세포내 기존의 신호전달기전에 첨가하여 새롭게 형성되는 신호전이 네트웍을 구축하였다.
- TEL은 CR1 promoter의 전사를 억제하고, AML1은 CR1 promoter의 전사를 활성화한다.
T/A 융합유전자는 전사를 억제하고 AML1에 의한 전사 활성도 억제한다.
-TEL의 전사조절과 세포내 위치를 결정하는데 HLH domain이 중요하고 핵에 존재한다.
AML1의 전사조절과 세포내 위치를 결정하는데 RUNT domain이 중요하고 핵에 존재한다.
-TEL과 T/A는 활성화되기 위해 dimerization한다. Dimerization을 위해서는 HLH domain이 필요하다.
- TSA를 처리했을 때 TEL은 전사억제 활성을 잃었으나 T/A는 영향을 받지 않는다.
전사와 관련된 보조인자들은 T/A와 결합한다.
-etoposide가 NF-kB를 활성화시키고, 이 과정은 PI3-Kinase/PDK1/Akt에 의하여 수행됨을 확인하였다. PI3- Kinase/PDK1/Akt pathway에 의한 NF-kB 활성화 기전은 기존에 알려진 IKK에 의한 IkB의 인산화 및 분해과정과는 별개로 작동하며, 여러 가지 방법으로 NF-kB의 활성화를 유도함을 밝혀내었다. 특히 흥미로운 것은 기존에 많은 연구가 수행된 여러 NF-kB stimulator에 의한 NF-kB 활성화는 대부분 p65 subunit에 집중되어 있었던 반면, 본 연구에서는 p50 subunit의 할성화에 관여하는 새로운 pathway를 밝힌 매우 흥미로운 결과를 제시하였다
-PI3-Kinase/PDK1/Akt pathway는 주로 p50 subunit의 인산화를 유도하고 이에 의하여 p50 subunit의 nuclear translocation을 유도하고 이에 의하여 p50/p50 homodimer의 DNA binding을 조절한다는 가능성을 제시한다.

Abstract ▼

Based on our preliminary experiments, we proposed that PDK1, an upstream regulator of PKB, plays a cardinal role in the modulation of other intracellular signal intermediates, like as a master controller. Thus, current research is aimed at the determination of the role of PDK1 and its interactors an

Based on our preliminary experiments, we proposed that PDK1, an upstream regulator of PKB, plays a cardinal role in the modulation of other intracellular signal intermediates, like as a master controller. Thus, current research is aimed at the determination of the role of PDK1 and its interactors and the establishment of the intracellular cross-talk system of PDK1.

-studies of intracellular interaction of PDK1 with STRAP, a TGF-$\beta$ receptor associated protein
-studies of intracellular interaction of PDK1 with MPK38, a new Ser/Thr kinase
-studies of intracellular interaction of PDK1 with PTP-BAS, a Tyr type phosphatase
-studies of intracellular interaction of PDK1 with NM23-H1, a tumor suppressor
-establishment of protein network of PDK1
-investigation of TEL, AML1, and TEL-AML1 effect on CR1 promoter
-investigation of suppression of AML1 activity by T/A in the CR1 promoter transcription
-examination of the promoter and expression of target genes (CR1, AML1)
-role of PI3K/PKB in the NF-kB activation induced by apoptosis
-suppression of $\beta$-catenin transcriptional activity by PDK1 in the apoptosis
-relatedness of PDK1 and Akt in the NF-kB activation induced by etoposide
-methods for NF-kB activation though PI3-kinase/PDK1/Akt pathway

-isolation of total nine PDK1 interacting proteins and three (STRAP, MPK38, PTP-BAS) of them were well characterized; more than 90$\percnt$ of data
-investigation of binding motifs of PDK1 in the interaction of STRAP and MPK38; kinase domain for STRAP, both kinase and PH domain for MPK38
-construction of expression vectors for total nine PDK1 interacting proteins and examination of their expression by transfection and immunoblot
-establishment of several kinase assay systems such as CDK4, MPK38, and PDK1 and, in addition, assay for STRAP activity, protein tyrosine phosphatase, and cell death are built
-studies for PDK1:STRAP and PDK1:MPK38 are almost accomplished and will be submitted, and the studies on the intracellular interaction of STRAP, a PDK1 interacting protein, will be soon accomplished for publication
-TEL suppresses the transcription of CR1 promoter, but AML1 stimulates the CR1 promoter transcription. T/A suppresses the transcription of CR1 promoter and additionally suppresses the transcriptional activation induced by AML1
-HLH domain plays a key role in determining the localization and transcriptional regulation of TEL, but RUNT domain is important to the localization and transcriptional regulation of AML1
-TEL interacts with T/A for activation and the HLH domain is involved in the dimerization
-TEL activity is lost when TSA is treated with TEL, but T/A is not
-confirmation of the involvement of PI3-Kinase/PDK1/Akt in the NF-kB activation induced by etoposide and the pathway of this activation is independent to the IkB phosphorylation. Interestingly, the activation of p50 subunit is involved in the NF-kB activation rather than the activation of p65 subunit
-PI3-Kinase/PDK1/Akt pathway in the NF-kB activation suggests the nuclear translocation of p50 subunit and making the p50/p50 homodimer for DNA binding

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...4
• 1. 국문요약문 ...4
• Ⅱ. 연구결과 요약문...5
• 1. 국문요약문 ...5
• 2. 영문요약문 ...6
• Ⅲ. 연구내용...7
• 1. 서론 ...7
• 2. 연구방법 및 이론 ...10
• 3. 결과 및 고찰 ...16
• 4. 결론 ...63
• 5. 인용문헌 ...66